雙菌發酵豆豉工藝條件篩選

陳 浩,王桂榮,劉同杰,何國慶

(1.浙江大學生物系統工程與食品科學學院,浙江杭州 210058;2.浙江省杭州市原種場,浙江杭州 311115)

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雙菌發酵豆豉工藝條件篩選

陳 浩,王桂榮,劉同杰,何國慶

(1.浙江大學生物系統工程與食品科學學院,浙江杭州 210058;2.浙江省杭州市原種場,浙江杭州 311115)

本文采用米曲霉和黑曲霉菌粉混合發酵制作豆豉,分別以蛋白酶活力和氨基態氮含量為測定指標,通過單因素實驗確定了豆豉制曲和發酵條件。結果表明,制曲條件為每1 kg黃豆接種菌粉15 g,米曲霉∶黑曲霉的用量比=4∶1,溫度30 ℃,相對濕度75%,制曲48 h,最終蛋白酶活力可以達到1033 u/g;發酵條件為每1 kg豆豉曲加入500 mL無菌水和50 g食鹽,溫度45 ℃,相對濕度65%,發酵11 d后氨基態氮含量達到2.1 g/100 g。

豆豉,制曲,發酵,工藝參數

豆豉是我國傳統的發酵豆制品,由于其豐富的營養和獨特的風味深受廣大消費者的喜愛。特別是在南方,既做菜肴,又作為調味品被廣泛食用。由于微生物發酵作用,不僅含有豐富的蛋白質、脂肪、碳水化合物、維生素和礦物質等營養成分[1],還形成了豐富的多肽、氨基酸、寡糖、單糖等,更容易被人體吸收,促進消化,適合于腸胃吸收障礙的人群、消化能力減退的老人和消化不良的兒童食用。

由于地域差異,所利用的微生物也不盡相同,主要有曲霉型豆豉[2-3],如湖南瀏陽豆豉;細菌型豆豉,如利用納豆芽孢桿菌生產的日本納豆[4];毛霉型豆豉,如重慶的永川豆豉[5];根霉型豆豉,如印尼的天培[6]。目前普遍采取的單菌種制曲生產豆豉,參與發酵的微生物較少,分泌的酶種類不全,常使豆豉成品的風味不及傳統發酵的豆豉,此研究利用多菌種發酵生產豆豉以提高其品質具有重要意義。同時,由于傳統工藝制作豆豉主要是在自然條件下發酵,豆豉制曲和發酵時間一般較長,而且豆豉的生產還受到季節的限制,大部分豆豉都是在氣溫較高的夏季制作的,并不能常年生產,因此嚴重影響了企業廠房的利用、豆豉的市場供求和生產規模的擴大,增加了生產成本。故本文對影響曲霉型豆豉制曲和發酵工藝因素進行研究,以提高豆豉的品質,縮短豆豉的制作周期。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆 黑龍江五常大豆;米曲霉(滬釀3.042)、黑曲霉(As 3.350)菌粉 山東沂源康源生物科技有限公司;福林(Folin)試劑、三氯乙酸、乙酸、乙酸鈉、碳酸鈉、L-酪氨酸、氫氧化鈉、鹽酸、甲醛 分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

BSA124S型電子分析天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;YXQ-LS-立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;CTHI-250B恒溫恒濕培養箱 施都凱儀器設備(上海)有限公司;SJB-CJ-1FX超凈工作臺 蘇州佳寶凈化工程設備有限公司;PB-10型酸度計 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;MULTISKAN GO酶標儀 Thermo Scientific公司;86-1型磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司;FSH-2A型勻漿機 江蘇金元市醫療儀器廠;TG16-WS臺式高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 豆豉制作工藝流程 黃豆→浸泡→蒸煮→接種→制曲→添加食鹽、水→發酵→曬干→調味→產品

挑選顆粒飽滿的黃豆,以大豆質量3倍的30 ℃溫水浸泡4 h,瀝干后置于高壓蒸煮鍋內121 ℃蒸煮20 min,冷卻至室溫,按一定的接種量接種菌粉,放入恒溫恒濕培養箱中,在一定的溫度和濕度條件制曲一定時間,制曲完成后裝入廣口玻璃瓶中,加入一定質量的食鹽和一定體積的無菌水,在一定的條件下發酵一段時間,發酵完成后烘干得到干豆豉,后續加入其它香辛料進行調配即可得到產品。

1.2.2 豆豉制曲工藝條件參數篩選 以蛋白酶活力為指標,對菌粉配比、接種量、制曲溫度、相對濕度和制曲時間等因素進行評估。

1.2.2.1 菌粉配比 挑選飽滿的原料大豆100 g,用清水洗干凈,然后加入300 mL,30 ℃的水浸泡4 h,瀝干后接入1 g菌粉(接種量1.0%,w/w),其中米曲霉和黑曲霉菌粉配比設置為5∶0、4∶1、3∶2、2∶3,在溫度為30 ℃、相對濕度75%的條件下制曲60 h后測定蛋白酶活力。

1.2.2.2 接種量 挑選飽滿的原料大豆100 g,用清水洗干凈,然后加入300 mL、30 ℃的水浸泡4 h,瀝干后按前一步篩選后的菌粉配比進行接種,接種量為2.0%、1.5%、1.0%、0.5%,在溫度為30 ℃、相對濕度75%的條件下制曲60 h后測定蛋白酶活力。

1.2.2.3 溫度 挑選飽滿的原料大豆100 g,用清水洗干凈,然后加入300 mL、30 ℃的水浸泡4 h,瀝干后按照篩選的菌粉配比和接種量進行接種,溫度設置為25、30、35、40 ℃,相對濕度75%的條件下制曲60 h后測定蛋白酶活力。

1.2.2.4 相對濕度 挑選飽滿的原料大豆100 g,用清水洗干凈,然后加入300 mL、30 ℃的水浸泡4 h,瀝干后按篩選的菌粉配比、接種量和發酵溫度進行接種,相對濕度設置為65%、70%、75%、80%和85%,制曲60 h后測定蛋白酶活力。

1.2.2.5 時間 挑選飽滿的原料大豆100 g,用清水洗干凈,然后加入300 mL,30 ℃的水浸泡4 h,瀝干后按上述篩選的工藝參數進行制曲,分別在12、24、36、48、60和72 h后取樣測定蛋白酶活力。

1.2.3 豆豉發酵工藝條件參數篩選 以氨基態氮含量為指標,對發酵溫度、相對濕度、含水量、加鹽量、發酵時間等因素進行評估。

1.2.3.1 溫度 大豆制曲完成后,每100 g加入15%的食鹽水40 mL,其中發酵溫度設置為30、37、45、50 ℃,相對濕度為75%的條件下發酵,測定氨基態氮含量。

1.2.3.2 相對濕度 大豆制曲完成后,每100 g加入15%的食鹽水40 mL,相對濕度分別設置為65%、75%、85%,在上一步篩選出的溫度條件下發酵,測定氨基態氮含量。

1.2.3.3 含水量 大豆制曲完成后,每100 g豆豉分別加入25、50、75、100 mL 15%的食鹽水,在前兩步篩選的溫度和濕度條件下發酵,測定氨基態氮含量。

1.2.3.4 加鹽量 大豆制曲完成后,每100 g豆豉曲加入50 mL水,分別加入2.5、5、7.5、10 g的食鹽,按上述篩選的工藝參數發酵,測定氨基態氮含量。

1.2.3.5 時間 大豆制曲完成后,按上述篩選的工藝參數發酵,每天測定氨基態氮含量。

1.3 指標的測定方法

1.3.1 蛋白酶活力的測定 按GB/T 23527-2009進行[7]。

1.3.2 氨基態氮含量的測定[8]樣品制備:稱取5 g(記為m)樣品于200 mL燒杯中,加入50 mL蒸餾水,用勻漿機打碎,轉入離心管中,在3500 r/min的條件下離心15 min,將上清液移入100 mL容量瓶中,再加10 mL蒸餾水于離心管沉淀中,搖勻并再次離心,上清液倒入容量瓶中,此操作反復3次,最后用蒸餾水定容至100 mL,混勻。

樣品測定:吸取10 mL樣品液于200 mL燒杯中,加入60 mL蒸餾水,用0.05 mol/L的NaOH溶液滴定至pH8.2,加入10 mL甲醛溶液混勻,再用0.05 mol/L的NaOH滴定至pH9.2,記下pH從8.2到9.2消耗的NaOH體積V1;空白實驗只需要將樣品換成10 mL蒸餾水,記下消耗的NaOH體積V2,氨基態氮含量(X)的計算公式如下:

1.4 數據處理

本文數據處理采用Microsoft Office Excel 2013,所有測定均平行進行3次。

2 結果與分析

2.1 制曲工藝條件參數的確定

2.1.1 菌粉配比對豆豉制曲蛋白酶活力的影響 由圖1可知,當米曲霉和黑曲霉菌粉的配比為4∶1時,制曲所產的蛋白酶活力最高。米曲霉滬釀3.042作為釀造動力微生物,其產酶豐富,如蛋白酶、肽酶、淀粉酶、纖維素酶等[9],這些酶系對豆豉制作發揮著不同作用,其中蛋白酶是關鍵酶。米曲霉產中性蛋白酶能力較強,而豆豉發酵是在中性和偏酸性的環境,而米曲霉產酸性蛋白酶的能力相對較弱,所以添加一定的黑曲霉可以互補[10],但黑曲霉產蛋白酶能力相對米曲霉弱些,故當米曲霉和黑曲霉菌粉的配比為4∶1時,制曲所產的蛋白酶活力最高。

圖1 米曲霉與黑曲霉菌粉配比對豆豉制曲蛋白酶活力的影響Fig.1 Effect of different proportion between Aspergillus oryzae and Aspergillus niger on protease activity in koji-making

2.1.2 接種量對豆豉制曲蛋白酶活力的影響 由圖2可知,隨著接種量的增加,蛋白酶活力逐漸增加,在接種量為1.5%達到最大,但當接種量進一步增加時,蛋白酶活力卻反而下降,可能是因為接種量太大,微生物生長過多,從而產生的溫度要高于微生物最適生長溫度,以及受于可被利用的營養物質的限制。所以確定1.5%的接種量為最佳接種量。

圖2 接種量對豆豉制曲蛋白酶活力的影響Fig.2 Effect of inoculum size on protease activity in koji-making

圖3 溫度對豆豉制曲蛋白酶活力的影響Fig.3 Effect of culture temperature on protease activity in koji-making

2.1.3 制曲溫度對豆豉制曲蛋白酶活力的影響 由圖3可知,隨著發酵溫度逐漸升高,豆豉曲蛋白酶活力逐漸升高,在35 ℃時酶活達到最大,但隨著溫度進一步增加,酶活力急劇下降。霉菌最適生長的溫度一般在室溫左右,溫度過低不利于微生物的生長及代謝,溫度過高容易產生“燒曲”現象,不利于微生物生長,且易使酶失活。30 ℃和35 ℃制曲產生的酶活相差不大,從環保節能的角度選擇30 ℃作為制曲的最佳溫度。

2.1.4 制曲濕度對豆豉制曲蛋白酶活力的影響 從圖4可以看出,隨著相對濕度的增加,蛋白酶活力先增加后又下降,在相對濕度為75%的酶活達到最大。這是因為霉菌生長需要一定的水分,適宜的濕度能使得原料保持較好的水分同時使得微生物處于平衡狀態,這樣有利于霉菌的生長,增加產酶量,但是濕度過大,使得培養箱內水分過高,這樣可能妨礙霉菌與外界環境的物質交換,不利于微生物的生長,從而使得酶活力下降。

圖4 濕度對豆豉制曲蛋白酶活力的影響Fig.4 Effect of culture humidity on protease activity in koji-making

2.1.5 制曲時間對豆豉制曲蛋白酶活力的影響 由圖5可知,隨著制曲時間的延長,蛋白酶活力呈現先增加后下降的趨勢,在48 h時達到最大。這是因為在48 h之前,微生物在生長,從而酶活也逐漸增加,在48 h時霉菌生長得旺盛,產酶能力也達到最大,酶活也相應得很高,而在48 h后,可能受于可利用的營養物質的限制以及菌種產酶能力衰退的緣故,蛋白酶活力逐漸下降。

圖5 制曲時間對豆豉制曲蛋白酶活力的影響Fig.5 Effect of culture time on protease activity in koji-making

2.2 豆豉發酵條件參數的確定

2.2.1 發酵溫度對豆豉發酵產氨基態氮的影響 由圖6可知,豆豉發酵在45 ℃時產生的氨基態氮含量最高,溫度或低或高都不利于豆豉發酵。豆豉的發酵首先是大分子物質如蛋白質在酶的催化下產生小分子的氨基態氮,溫度低不利于酶催化反應,過高易使酶失活,實驗發現45 ℃為最佳發酵溫度。

圖6 溫度對豆豉發酵產氨基態氮含量的影響Fig.6 Effect of temperature on amino nitrogen content during fermentation

2.2.2 發酵濕度對豆豉發酵產氨基態氮的影響 從圖7可知,當濕度為65%時,豆豉發酵產氨基態氮含量最高,濕度過高或過低都不利于發酵。這是因為相對濕度與豆豉中的含水量相關,只有在合適的濕度下,豆豉和微生物才能保持較好的水分,從而有利于豆豉發酵,濕度過低,豆豉內的水分會蒸發出來,這樣不利于微生物的生長以及蛋白質水解成氨基態氮,濕度過高,豆豉含水量高,豆豉表面附著水分,不利于內外界的物質交換,因此65%的相對濕度為最佳。

2.2.3 加水量對豆豉發酵產氨基態氮的影響 豆豉發酵前期是大豆中的蛋白質在微生物分泌的酶的催化下發生的水解反應,所以必須有水參加,從圖8可知,當加水量太低,不利于蛋白質水解成氨基態氮,保持較高的水分有利于蛋白質的分解,但是水分過高,豆豉呈現醬狀或者糊狀,不能夠保持豆豉原有的顆粒狀。從而控制加水量在一定范圍內有利于豆豉發酵,從節約的角度,優先選擇水∶豆豉曲=1∶2。

圖8 含水量對豆豉發酵產氨基態氮含量的影響Fig.8 Effect of water content on amino nitrogen content during fermentation

2.2.4 加鹽量對豆豉發酵產氨基態氮的影響 由圖9可知,當含鹽量為5.0%時,豆豉發酵效果較好。豆豉發酵過程中需要添加一定的食鹽,這不僅有利于最終成品的風味品質,而且還與微生物生長有很大關系。高鹽能夠抑制微生物的生長以及蛋白酶活力,阻礙了蛋白質分解,從而氨基態氮含量下降,影響豆豉的營養和風味,所以控制加鹽量對于豆豉成品品質至關重要。

圖9 加鹽量對豆豉發酵產氨基態氮含量的影響Fig.9 Effect of salt content on amino nitrogen content during fermentation

2.2.5 發酵時間對豆豉發酵產氨基態氮的影響 發酵時間決定了豆豉成品品質,比如風味,口感[11-12]。從圖10可知,隨著發酵天數的增加,豆豉發酵產氨基態氮含量逐漸增加,在11 d達到最高,之后趨于穩定。從節約成本和縮短周期的角度確定11 d為最佳發酵時間。

圖10 時間對豆豉發酵產氨基態氮含量的影響Fig.10 Effect of time on amino nitrogen content during fermentation

2.3 驗證實驗

取1 kg飽滿的黃豆顆粒,用清水清洗直至干凈,加入3 L的30 ℃溫水浸泡4 h后,瀝干水分,放入121 ℃高壓蒸煮鍋內蒸煮20 min,冷卻至室溫,獲得煮熟的黃豆顆粒。向煮熟的黃豆顆粒中接入15 g混合菌粉,其中米曲霉和黑曲霉菌粉的質量比為4∶1,混合均勻,放入培養箱中制曲48 h,溫度為30 ℃,相對濕度為75%,取樣測定蛋白酶活力。

制曲完成過后,添加食鹽和無菌水,以質量計,每1 kg的豆豉曲加入50 g食鹽和500 mL的無菌水,將溫度調到45 ℃,相對濕度調為65%,發酵11 d,得到發酵豆豉,取樣測定氨基態氮含量。

制曲完成后,蛋白酶活力達到1033 u/g;發酵完成后,氨基態氮含量達到2.1 g/100 g;成品豆豉呈黑褐色顆粒狀,有濃濃的豆香味,口感柔軟,有一定的咸味。

3 結論

通過單因素實驗考查不同條件對豆豉制曲產蛋白酶的影響,得到的制曲條件為每1 kg黃豆接種15 g菌粉、米曲霉∶黑曲霉=4∶1、溫度30 ℃、相對濕度75%,制曲48 h,最終蛋白酶活力可以達到1033 u/g;在此制曲條件下,通過單因素實驗考查不同條件對豆豉發酵產氨基態氮的影響,得到的發酵條件為溫度45 ℃、濕度65%、每1 kg豆豉曲加入500 mL無菌水和50 g食鹽,發酵11 d后氨基態氮含量達到2.1 g/100 g。傳統工藝生產豆豉需要一個月甚至更長,該工藝條件能夠縮短豆豉生產周期,降低成本,對豆豉生產規模化具有重要意義。

[1]李學貴. 豆豉及豉油的生產技術[J]. 江蘇調味副食品,2011(3):27-30.

[2]楊軍,陳九武,彭仲雄,等. 曲霉豆豉生產工藝的研究[J]. 中國調味品,1998(4):17-18.

[3]蔣立文,周雙都. 曲霉型(瀏陽)豆豉現狀和發展前景[J].中國釀造,2003,205(6):4-6.

[4]尹召軍,陳衛平,張鳳英.細菌型豆豉生理活性物質的研究進展[J].中國糧油學報,2011,26(3):119-122.

[5]李幼筠,周邐.中國獨具特色的發酵豆制品—論四川固態輔料類豆腐乳、毛霉型豆豉及豆瓣辣醬[J].中國釀造,2010(4):12-16

[6]劉全德,劉恩岐,賀菊萍,等.多菌種發酵丹貝的制作工藝與營養成分分析[J].食品與發酵工業,2011,37(3):104-108.

[7]GB/T 23527-2009,蛋白酶制劑[S].

[8]房翠蘭. 豆豉加工過程中蛋白質和膳食纖維生物學變化的研究[D].重慶:西南大學,2007.

[9]陳紅梅,潘力. 米曲霉3.042種曲蛋白酶特性研究[J]. 中國調味品,2009,3:63-65.

[10]李保英,姜佳麗,蔣予箭. 醬油生產中應用米曲霉和黑曲霉混合制曲的探索[J]. 中國釀造,2011,(12):70-73.

[11]索化夷,盧露,吳佳敏,等. 永川豆豉在傳統發酵過程中基本成分及蛋白酶活性變化[J]. 食品科學,2011,32(1):177-180.

[12]S Lertsiri,K Phontree,W Thepsingha,et al. Evidence of enzymatic browning due to laccase-like enzyme during mash fermentation in Thai soybean paste[J]. Food Chemistry,2003,80(2):171-176.

Selection of technological parameters of Douchi fermented by multi-strains

CHEN Hao1,WANG Gui-rong2,LIU Tong-jie1,HE Guo-qing1,*

(1.College of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China;2.Hangzhou Original Seed Farm,Hangzhou 311115,China)

The starter mixture ofAspergillusoryzaeandAspergillusnigerwere used to produce Douchi and the protease activity and amino nitrogen content were respectively used as the indexes to explore the parameters of koji-making and fermentation by single factor test. The results showed that one good conditions of koji-making are as follows:15 g fungus powder in 1 kg soybean,Aspergillusoryzae∶Aspergillusniger=4∶1,30 ℃,75% RH and duration of 48 h,under these conditions,the protease activity reached 1033 u/g. One good conditions of fermentation were as follows:500 mL water and 50 g salt in 1 kg koji,45 ℃,65% RH and duration of 11 days,under these conditions,the amino nitrogen content reached 2.1 g/100 g.

Douchi;koji-making;fermentation;technological parameters

2016-03-09

陳浩(1990-),男,碩士研究生,研究方向:發酵工程,E-mail:21413057@zju.edu.cn。

*通訊作者:何國慶(1957-),男,博士,教授,研究方向:發酵工程,E-mail:gqhe@ zju.edu.cn。

TS264.2

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000