罕見RET原癌基因Y606C突變所致家族性甲狀腺髓樣癌家系臨床特點分析*

王軍軼 于洋 李大鵬 魏松鋒 運新偉 賈永勝 高明

·臨床研究與應用·

罕見RET原癌基因Y606C突變所致家族性甲狀腺髓樣癌家系臨床特點分析*

王軍軼 于洋 李大鵬 魏松鋒 運新偉 賈永勝 高明

目的：分析討論RET原癌基因Y606C這一罕見突變所致家族性甲狀腺髓樣癌（familial medullary thyroid carcinoma，FMTC）的臨床生物學特點。方法：對先期確診的1個攜帶RET原癌基因Y606C種系突變的FMTC家系成員進行RET基因種系突變篩查，同時行血清降鈣素、甲狀旁腺素、頸腹部超聲等相關臨床檢查，對患病成員和攜帶者給予臨床干預，并總結分析上述病例臨床生物學特點。結果：包括先證者在內，該家系中10例參與基因篩查，發現6例攜帶RET基因第10外顯子Y606C突變。其中3例確診為FMTC患者（含先證者），均為女性，平均發病年齡50.0（47～53）歲。發病成員臨床均表現為甲狀腺腫物伴降鈣素升高，未發現甲狀旁腺和腎上腺病變。2例行全甲狀腺切除術，1例行患側腺葉切除術。術后病理均確診為甲狀腺髓樣癌，其中2例病理分期均屬早期，術后隨訪期間均達生化治愈。家系中另有3例為突變攜帶者，平均年齡33.0（15～55）歲。其中2例頸部超聲均提示甲狀腺腫物（考慮良性），另1例頸部超聲未見異常。除1例拒絕降鈣素檢測外，其余2例血清降鈣素均正常范圍，建議定期復查。結論：RET原癌基因Y606C突變可以導致FMTC發病，家系成員發病平均年齡較大，腫瘤分期較早，生化治愈率高，預后較好；家系成員基因檢測結合頸部超聲和降鈣素檢查有利于甲狀腺髓樣癌的早期診斷；對于無癥狀Y606C突變攜帶者，應根據其降鈣素水平及頸部超聲檢查情況實施個體化臨床處置。

RET原癌基因 突變 癌 髓樣 甲狀腺腫瘤

甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）發生于能分泌降鈣素的甲狀腺濾泡旁細胞（C細胞），占甲狀腺惡性腫瘤的4%～8%［1］，分為散發性甲狀腺髓樣癌（sporadic medullary thyroid carcinoma，SMTC）和遺傳性甲狀腺髓樣癌（hereditary medullary thyroid carcinoma，HMTC）兩種，后者占25%～30%［2］。目前，大量研究提示HMTC是一種單基因顯性遺傳病，RET原癌基因種系突變是其發病的主要分子病因學基礎，95%HMTC患者均可找到RET基因種系突變［3］。本研究報道一個攜帶罕見RET基因Y606C突變的中國漢族HMTC家系，分析攜帶該突變的家系成員臨床生物學特點，并探討診治要點。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本文研究對象為一個先期于天津醫科大學腫瘤醫院甲狀腺頸部腫瘤科確診的FMTC家系（圖1），漢族，包括先證者在內共3代10例。本研究方案經天津醫科大學腫瘤醫院倫理委員會審核通過。所有受試者均本人或其法定代理人（監護人）簽署知情同意書。1.2方法

1.2.1 RET基因種系突變檢測收集該家系10例外周血，提取基因組DNA，分別對RET基因第8、10、11、13、14、15、16外顯子進行PCR擴增，上述外顯子涵蓋絕大部分已報道突變位點，產物純化后直接測序。引物序列及退火溫度［4］，見表1。PCR反應體系為20 μL，反應條件：95℃預變性5 min，然后依次為95℃變性30 s，58℃～65℃退火30 s，72℃延伸30 s，經過36個循環，最后72℃延伸10 min。PCR產物經由1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析，溴化乙錠染色，紫外凝膠成像系統觀察，了解產物大小和純度。PCR產物使用ABI 3730 XL DNA自動測序儀，應用Sanger雙脫氧鏈終止法雙向測序。引物序列合成及PCR產物測序均由上海生工生物工程公司完成。測序結果利用MUTATION SURVEYOR（Version 4.0；Soft Genetics，USA）軟件進行自動分析，初步確定突變位點，再參照在線GeneBank數據庫中參考序列進行人工BLAST比對驗證。最后利用Chromas 2.5.1軟件截取突變位點的測序圖譜并保存。

1.2.2 相關影像學檢查及生化指標檢測頸部及腎上腺檢查首選超聲，其中甲狀腺超聲檢查采用甲狀腺超聲影像報告系統（thyroid imaging reporting and data system，TI-RADS）進行評級，一般1～3級評判為良性傾向，4～6級評判為惡性傾向［5］。同時結合血清降鈣素、甲狀旁腺素、血鈣等生化檢查。如有甲狀旁腺或腎上腺可疑病變需進一步行SPECT或CT等影像學檢查及24 h尿香草基杏仁酸（vanillylmandelic acid，VMA）定量檢測。

圖1 家族性MTC家系的系譜圖Figure 1Pedigree of RET proto-oncogene mutation Y606C in familial medullary thyroid carcinoma

表1 RET基因擴增外顯子引物序列及PCR反應條件Table 1Primers and PCR conditions for amplification of RET exons

表1 RET基因擴增外顯子引物序列及PCR反應條件（續表1）Table 1Primers and PCR conditions for amplification of RET exons

1.2.3 臨床情況調查及家系分析收集上述家系成員的一般情況，突變攜帶者相關臨床特征和隨訪情況，采用系譜分析法繪制系譜圖。

2 結果

2.1 RET基因種系突變情況

10例家系成員均參與基因檢測，測序結果顯示：包括先證者在內，該家系中共有6例攜帶RET基因第10外顯子第606密碼子TAT→TGT，所編碼氨基酸由酪氨酸（tyrosine，Tyr）替換為半胱氨酸（cysteine，Cys）的雜合錯義突變，即Y606C突變（圖2）。其余家系成員均未檢出該RET基因種系突變，亦未檢出RET基因其他位點突變。家系分析顯示，該家系第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ代成員中均有突變基因攜帶者。先證者的母親（Ⅰ2）為該家系突變來源。

2.2 臨床情況

該家系中，6例有攜帶突變，具體臨床特征見表2，其中3例確診FMTC（含先證者），均為女性，平均發病年齡50.0（47～53）歲。先證者（Ⅱ5）曾于5年前在當地醫院超聲發現甲狀腺左葉腫物，行甲狀腺左葉切除術，術后病理提示：MTC。3年前患者至天津醫科大學腫瘤醫院就診，提供其母亦患MTC的家族史，進一步RET基因突變篩查發現RET基因Y606C突變，臨床檢查未發現甲狀旁腺及腎上腺病變，定期復查血清降鈣素及頸部超聲。1年前該患者復查基礎降鈣素再次升高至16.20 ng/L，頸部超聲未見異常。患者接受建議將剩余甲狀腺右葉切除，病理確診：甲狀腺右葉局灶C細胞增生。術后復查降鈣素＜2.00 ng/L；先證者母親（Ⅰ2），30年前曾于當地醫院因甲狀腺腫物行甲狀腺左葉切除術，術后病理提示MTC（既往病歷資料無法獲得，上述信息均為患者口述）。該患者拒絕接受進一步臨床檢查，自述無頸前包塊、腹瀉、高血壓、頭痛、骨痛、骨折、尿路結石等相關癥狀；（Ⅱ3）為先證者二姐，基因篩查提示攜帶突變，進一步體檢超聲發現甲狀腺右葉腫物（TI-RADS 3級），血清基礎降鈣素30.32 ng/L，于天津醫科大學腫瘤醫院行全甲狀腺切除手術，病理確診：MTC（右葉），術后復查降鈣素＜2.00 ng/L。Ⅱ3、Ⅱ5全甲狀腺切除術后隨訪12～35個月均達生化治愈。家系中另有3例為突變攜帶者，其中男性1例，女性2例，平均年齡33.3（15～55）歲。其中Ⅱ1為先證者姐姐，55歲，頸部超聲提示甲狀腺左葉腫物（TI-RADS 2級），未接受降鈣素檢測及其他臨床檢查處理。Ⅱ1之女Ⅲ1，30歲，頸部超聲檢查及血清降鈣素水平均未見異常。Ⅱ3之子Ⅲ2，15歲，頸部超聲提示雙側甲狀腺葉多發囊性小結節（TI-RADS 1級），血清降鈣素正常范圍。

圖2 RET原癌基因第10外顯子606密碼子野生型與先證者測序結果Figure 2Sequence analysis of the amplified DNA from exon 10 of RET in the wild type and mutated allele of the index patient showing RET mutation at 606 codon.TAT→TGT nucleotide substitution(arrows)leading to a tyrosine to cysteine amino acid change in the mutated allele

表2 家系中Y606C突變攜帶者臨床特征Table 2Clinical features of Y606C RET mutation carriers

3 討論

HMTC臨床表現為多發性內分泌腺瘤病2型（multiple endocrine neoplasia type 2，MEN2），根據受累的腺體的不同，MEN2最初分為3個亞型：多發性內分泌腺瘤病2A型（multiple endocrine neoplasia type 2A，MEN2A），除表現MTC外患者可合并腎上腺嗜鉻細胞瘤和甲狀旁腺功能亢進［6］；多發性內分泌腺瘤病2B型（MEN2B），患者除患有MTC和腎上腺嗜鉻細胞瘤外，常合并有多發性黏膜神經瘤病和馬凡體征，病情最為嚴重；FMTC表現為多個家族成員僅患MTC而無其他腺體受累為特征［7］。需要注意的是本型應與早期MEN2A僅有MTC發病，而尚未表現腎上腺及甲狀旁腺病變的患者相鑒別。根據美國甲狀腺協會2015年公布的《甲狀腺髓樣癌管理指南修訂版》（以下簡稱《指南》），FMTC已被列屬于MEN2A的一種特殊亞型［8］。本家系中發病的3例MTC患者分處2代，且有4例突變攜帶者年齡均＞50歲，無甲狀腺以外其他腺體受累表現，可以診斷為MEN2A的FMTC亞型。

分子病因學研究已明確HMTC的致病基因為RET原癌基因，位于10號染色體長臂，含21個外顯子，編碼一組屬于酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TK）受體跨膜蛋白［9］。RET受體蛋白主要分布在神經管嵴源性細胞上，對這些細胞的增殖、分化、存活等過程中起重要調控作用。RET基因突變導致蛋白構象改變，可增強RET蛋白的轉化能力，激發TK自動磷酸化，誘導細胞過度增生以致癌變［10］。近些年文獻已經報道我國較多的RET基因種系突變位點，這些位點多數位于編碼胞外區（如10外顯子的609、611、618密碼子）和跨膜區（如11外顯子的634密碼子），少數位于胞內編碼區（如16外顯子的918密碼子），并對不同突變位點突變所對應的臨床表型進行歸納總結［4，11］。既往文獻報道FMTC多與第10外顯子的609、611、618、620密碼子突變有關，上述突變位點均為編碼胞外區的密碼子，突變致胞外Cys殘基改變，進而導致RET受體蛋白不依賴配體激活，自我交叉磷酸化，達到激活狀態［10］。然而，在本研究中位于第10外顯子上的606密碼子并非編碼Cys，而是編碼位于RET蛋白Cys富集區外側配體結合區域的一個Tyr。突變導致該Tyr被Cys替代，從而使RET蛋白受體在不依賴配體結合的情況下形成二聚體自動磷酸化，進而激活下游信號傳導通路［12］。

臨床方面，根據新版《指南》，606密碼子突變屬于中危突變（moderate risk），意味著MTC侵襲性較弱，患者常具有較低的血清降鈣素水平和更高的生化治愈率［8］。迄今為止，RET基因606密碼子突變相關報道只有2篇，所報道的2例MTC患者所攜帶突變均為Y606C，其中1篇所報道唯一患者診斷年齡為58歲，除MTC不伴有其他內分泌系統腫瘤［12］。另1篇報道中患者也僅表現為MTC，發病年齡不詳，其9歲女兒亦攜帶該突變，無發病跡象［13］。結合本研究家系情況，3例患者診斷年齡均＞45歲。除Ⅰ2早年于外院行腺葉切除手術外，其余2例患者均行全甲狀腺切除術（先證者行2次手術），術后病理分級原發灶T1～T2，頸部均未發現淋巴結轉移，術后隨訪均達生化治愈。因此，該家系中MTC亦表現為侵襲性較弱，手術治療效果好。

對于突變攜帶者的處理，《指南》建議：攜帶中危突變的兒童應該在5歲左右開始每年行頸部超聲、血清降鈣素檢測進行發病評估。在降鈣素水平正常的情況下可以暫不行甲狀腺切除手術。擔心長期評估計劃或有發病顧慮的父母也可以和外科醫生兒科醫生進行磋商來決定甲狀腺切除的時間。本研究該家系3例突變攜帶者中，55歲成員Ⅱ1超聲檢查已發現甲狀腺左葉TI-RADS 2級腫物，但由于未接受降鈣素水平檢測及其他檢查，尚無法明確是否發病。30歲成員Ⅲ1目前為止頸部超聲和血清降鈣素檢查均無異常，建議定期復查。15歲攜帶者Ⅲ2，超聲提示雙側甲狀腺葉多發囊性小結節（TI-RADS 1級），最大直徑4 mm，血清降鈣素＜2.00 ng/L，建議定期復查。需要注意的是，由于早期MTC多邊界清晰，形態規整，尤其部分不伴鈣化MTC易與良性腺瘤相混淆。本研究中多例發病者甲狀腺超聲腫物超聲分級均較低，因此不應忽視對TI-RADS分級較低甲狀腺腫物性質的鑒別，應結合降鈣素水平做出綜合評價。

綜上所述，本研究中攜帶RET基因Y606C種系突變的FMTC家系，成員發病年齡普遍較大，腫瘤分期較早，全甲狀腺切除后生化治愈率較高。基因篩查結合甲狀腺超聲檢查和降鈣素水平檢測有利于該病的早期診斷。對于無癥狀突變攜帶者，可在密切監測降鈣素水平及頸部超聲的前提下，結合實際情況實施個體化臨床處置。

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（2016-08-29收稿）

（2016-09-27修回）

（編輯：孫喜佳校對：楊紅欣）

The rare RET mutation Y606C in a Chinese family with familial medullary thyroid carcinoma

Junyi WANG,Yang YU,Dapeng LI,Songfeng WEI,Xinwei YUN,Yongsheng JIA,Ming GAO
Department of Thyroid and Neck Tumor,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin's Clinical Research Center for Cancer,Tianjin 300060,China
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81502322)

Ming GAO;E-mail:gaoming68@aliyun.com

Objective:A study was conducted to investigate the biological characteristics of familial medullary thyroid carcinoma (FMTC)caused by rare RET proto-oncogene mutation Y606C and to discuss treatment options.Methods:Systemic medical data,including RET germline mutation screening,biochemical testing,imaging examinations,clinical management,and postoperative followup,were obtained from 10 members of the 3-generate FMTC family.These data were confirmed previously.The clinical features of the above-mentioned cases were summed up.Results:RET screening showed heterozygous missense mutation of Y606C on exon 10 in 6 cases.Among the 6 carriers,3 cases(including the index patient)have been affected by MTC.The mean age of these patients at the time of diagnosis was 50.0 years old(in the range of 47-53 years old).The manifestations associated with MTC included thyroid nodules and elevated levels of calcitonin.Two patients accepted total thyroidectomy and one patient underwent lobectomy.MTC was confirmed by postoperative pathology and all tumors were early stage without regional lymph node metastasis.Biochemical cure was achieved during the follow-up.The mean age of three mutation carriers was 33.0 years(in the range of 15-55 years).Among the three carriers,multiple thyroid lesions have been detected by ultrasound in a 55-year-old female and a 15-year-old male.One carrier rejected further clinical examinations.The other two carriers'serum calcitonin levels were normal.Thus,close observation was recommended.Conclusion:RET mutation of Y606C might lead to pathogenesis of FMTC,which is associated with older age of onset,earlier tumor stage,higher biochemical cure rate,and better prognosis.Molecular screening of the RET gene in FMTC family members,combined with ultrasound and thyroid calcitonin examinations,may be helpful in the early diagnosis of MTC.For asymptomatic Y606C mutation carriers,management should be individualized based on calcitonin level and neck ultrasound.

RET proto-oncogene,mutation,carcinoma,medullary,thyroid cancer

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.21.010

天津醫科大學腫瘤醫院甲狀腺頸部腫瘤科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心（天津市300060）

*本文課題受國家自然科學基金項目（編號：81502322）資助

高明gaoming68@aliyun.com

王軍軼專業方向為甲狀腺癌的臨床治療與基礎研究。

E-mail：jzxsya@163.com