柴胡疏肝散對肝氣郁結證大鼠海馬及下丘腦單胺類神經遞質的影響

馬玉峰，王嘉麟，邢 佳，朱曉晨，岳廣欣，王玉來，郭蓉娟，賀立娟

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·基礎醫學論著/研究·

柴胡疏肝散對肝氣郁結證大鼠海馬及下丘腦單胺類神經遞質的影響

馬玉峰1，王嘉麟2，邢 佳2，朱曉晨2，岳廣欣3，王玉來2，郭蓉娟2，賀立娟2

目的 研究柴胡疏肝散對肝郁證大鼠行為學和大鼠海馬及下丘腦單胺類神經遞質的影響。方法 用慢性束縛應激結合孤養法建立肝郁證大鼠模型，測評開野、蔗糖水實驗，采用高效液相色譜法測定大鼠海馬及下丘腦單胺類神經遞質。結果 模型組大鼠的行為學發生了明顯變化，海馬及下丘腦中5-羥色胺(5-HT)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)、多巴胺(DA)含量均下降，去甲腎上腺素(NE)含量呈增加趨勢，而柴胡疏肝散能調控其變化趨勢。結論 柴胡疏肝散能改善肝郁證大鼠行為學的變化，具有治療肝郁證的作用，其作用機制可能與其能夠調節肝郁證大鼠腦5-HT、5-HIAA、NE、DA有關，從而有效發揮抗肝郁作用。

肝氣郁結證；柴胡疏肝散；單胺類神經遞質；5-羥色胺；5-羥吲哚乙酸；多巴胺

本實驗用慢性束縛應激結合孤養法建立了肝氣郁結證(肝郁證)大鼠模型，觀察柴胡疏肝散對該模型行為學和大鼠海馬及下丘腦單胺類神經遞質的影響，為進一步探討肝郁證的內涵提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性Wistar大鼠40只，體重180 g±10 g，SPF/VAF級，動物許可證號：SCXK(京)2006-0009，由北京維通利華實驗動物中心提供。光照節律12L：12D (07：00～19：00)，室溫22 ℃±1 ℃，空氣濕度40%～50%，給予常規顆粒飼料及飲用水，實驗環境安靜舒適。適應性飼養1周，5只/籠。

1.2 藥物 本實驗所用柴胡疏肝散出自《景岳全書·古方八陣》，組方：柴胡6 g，陳皮6 g，川芎5 g，香附5 g，枳殼5 g，白芍5 g，甘草3 g。由解放軍總醫院中藥房提供，經藥劑科鑒定均為正品，經冷水浸泡藥材2 h，常規兩煎，頭煎30 min，二煎20 min，將兩次水煎液混合并過濾，經水浴蒸發濃縮成含生藥0.52 g/mL的濃縮藥液冷藏備用。大鼠給藥劑量按人與動物體表面積折算(參考《藥理實驗方法學》第4版)，灌胃容積按1 mL /100 g換算。

1.3 儀器 美國ESA公司的5600A型高效液相色譜系統；8通道庫侖電化學檢測器(Model 5600A Coularray Detector-8)；電極：ESA Model 6210 fourchannel cell；582型泵；軟件：ESA Software Version；Sigma-3K15超速低溫離心機；NANOpure Diamond超純水機；MJ-300超聲波發生器；AG285電子分析天平；KONTES微量電動勻漿器；自制敞箱(80 cm×80 cm×40 cm)。

1.4 試劑 蔗糖(分析純，北京化學試劑有限公司提供)，溶于蒸餾水中配制成1%蔗糖溶液；去甲腎上腺素(NE，sigma A9512)；3，4-二羥基苯乙酸(DOPAC，sigma 850217)；多巴胺(DA，sigma H8502)；高香草酸(HOMV，sigma H1252)；5-羥色胺(5-HT，sigma 9523)；5-羥吲哚乙酸(5-HIAA，sigma H8876)；3，4二羥基芐胺(DHBA，sigma 37616)；1-辛烷磺酸鈉(TEDIA)；一水檸檬酸；乙腈(Thermo)；高氯酸；焦亞硫酸鈉；乙二胺四乙酸，實驗用水為超純水。

1.5 方法

1.5.1 模型建立及分組 40只大鼠適應性飼養1周后，進行開野實驗(Open-field test)，將合格且評分相近的30只大鼠隨機分為3組：空白對照組(對照組)、肝郁證模型組(模型組)、柴胡疏肝散組(治療組)，每組10只。模型建立：參照文獻[1-3]，用慢性束縛應激結合孤養法建立肝郁證大鼠模型。將造模大鼠放入特制的細鋼絲網籠內，使其行走困難、活動受限，束縛籠空間大小可調節；隨之將被束縛的大鼠放入小型鼠籠，1只/籠。每日束縛制動1次，每次束縛6 h(其余時間單籠孤養)，每日開始時間隨機，連續21 d。造模大鼠在束縛期間禁食水。

1.5.2 干預措施 對照組：群養，5只/籠，不做任何刺激，生理鹽水灌胃，每日1次；模型組：細鋼絲網籠束縛結合孤養，生理鹽水灌胃，每日1次；治療組：細鋼絲網籠束縛結合孤養，柴胡疏肝散煎劑(0.52 g/mL)灌胃，每日1次。自造模之日起開始灌胃，灌胃時間為21 d。

1.5.3 行為學測定 開野實驗，用Open-field test法進行測試。由兩位評定者評定每只大鼠在3 min內的運動情況。蔗糖水實驗[4]，分別在造模前1 d和造模第22 天測定各組大鼠的蔗糖水偏好值[糖水偏好值=糖水消耗量/總液體消耗量×100%]。

1.5.4 前額葉皮質、海馬單胺類神經遞質含量變化

1.5.4.1 組織樣品制備 3組實驗大鼠均于末次給藥第2天上午，10%水合氯醛麻醉后斷頭處死，從枕骨大孔向口腔側進刀，剪開顱骨，剝去頭頂骨，剪斷視神經，用鑷子取出整個腦組織，迅速以預冷的人工腦脊液沖去腦組織表面的血液，用濾紙吸去血液及多余的腦脊液。參照George Paxions的大鼠腦立體定位圖譜[5]定位，在冰盤上剝離大腦，取前額葉皮質、海馬及下丘腦，標記稱重后分別裝入1.5 Ml Eppendorf管，放置于液氮或-80 ℃冰箱保存，待樣品集齊后成批檢測。檢測前將稱重后的腦組織(20 mg～50 mg)，加0.5 mL預冷的工作內標液，于冰浴下用電動微量勻漿器快速勻漿，靜置10 min，4 ℃條件下14 000 r/min低溫離心15 min，取上清液，用Millipore 0.22 μm針頭式過濾器過濾，放入自動進樣器中待測。神經遞質含量按ng/g組織重量計算。

1.5.4.2 色譜條件 預柱：ESA HR-80，4.6 cm×8 cm；色譜柱：ESA MD-150(3.2 mm×150 mm)；流動相：90 mmol/L 磷酸二氫鈉， 1.7 mmol/L 1-辛烷磺酸鈉，50 mmol/L 檸檬酸，50 μmol/L EDTA，10% 乙腈，pH 約為3.00。流速：0.6 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃；設置4道電勢分別為：-150 mV、200 mV、350 mV、500 mV。

2 結 果

2.1 行為學變化 模型組大鼠水平運動、垂直運動得分明顯下降，糞便粒數增多，與對照組相比有統計學意義(P<0.01)，中央格停留時間有上升趨勢；而治療組大鼠水平運動得分、垂直運動得分均高于模型組，糞便粒數減少，與模型組比較有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，中央格停留時間有減少趨勢。造模前組間比較無差異；造模21 d后，與對照組相比，模型組大鼠蔗糖水偏好值明顯下降(P<0.01)；而治療組大鼠蔗糖水偏好值高于模型組(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組開野實驗、蔗糖水實驗結果(±s)

2.2 海馬及下丘腦單胺類神經遞質含量變化

2.2.1 海馬單胺類神經遞質含量變化 模型組海馬中5-HT、5-HIAA與DA含量均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，NE與對照組相比呈增加趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；治療組與對照組海馬中5-HT、5-HIAA、DA、NE含量相比差異無統計學意義(P>0.05)；治療組與模型組相比，5-HT、5-HIAA與DA含量均增加，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，NE含量呈減少趨勢，但無統計學意義(P>0.05)。詳見表2、圖1。

表2 各組海馬5-HT、5-HIAA、DA、NE含量比較(±s) ng/g

圖1 實驗大鼠海馬樣本5-HT、5-HIAA、DA、NE色譜圖

2.2.2 下丘腦單胺類神經遞質含量變化 模型組下丘腦中5-HT、5-HIAA與DA含量均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，NE與對照組相比呈增加趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；治療組與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)；治療組與模型組相比，5-HT與DA含量均增加，差異有統計學意義(P<0.05)，5-HIAA含量呈增加趨勢，NE含量呈減少趨勢，但差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表3、圖2。

圖2 實驗大鼠下丘腦樣本5-HT、5-HIAA、DA、NE色譜圖

3 討 論

研究認為肝氣郁結證(肝郁證)是在壓抑、焦慮、悲痛等負性情緒心理應激狀態下，以高級神經中樞調節機制紊亂為前提，對神經、內分泌、循環、消化、免疫、感覺、運動等多系統病理改變、病證表現的概括[6]。柴胡疏肝散出自《景岳全書》，原方用于“治胸脅疼痛，寒熱往來”，是臨床治療肝氣郁結證的古典名方。由柴胡、陳皮、川芎、香附、枳殼、芍藥、炙甘草七味中藥組成，具有疏肝解郁，行氣止痛之功效。本實驗用慢性束縛應激結合孤養法成功建立了肝郁證大鼠模型，其行為學表現主要是情緒低落、興趣減退、活動度降低、探究行為減少以及體重增加緩慢、攝食量減少、大便異常等。慢性制動是研究心理應激的一個較為可靠的方法，特別是用于研究中醫所述的“郁怒傷肝，肝失疏泄”的病理改變[7]。模型組大鼠水平運動、垂直運動得分明顯下降，提示其活動度及好奇程度均下降，而柴胡疏肝散可改善其變化。蔗糖水偏好值下降與快感缺乏密切相關。模型組大鼠蔗糖水偏好程度下降，提示其對美味食物(蔗糖水)快感缺乏，而柴胡疏肝散組未見快感缺乏。單胺類神經遞質是中樞神經系統中的一類神經遞質，包括5-HT、DA、NE、腎上腺素(A)、組胺等。其中，5-HT、DA與NE有著非常重要的生理功能，三者相互影響，其作用十分廣泛，主要與精神活動、行為及情緒等密切相關，對哺乳動物的神經系統功能、內臟功能及應激反應，尤其是對中樞神經系統的興奮或抑制起著協調作用[8]。單胺類信號擾動可以改變成年人的行為：在出生后早期，5-HT敏感期，單胺類信號擾動可影響焦慮和抑郁癥相關的行為；在圍青春期，5-HT和DA敏感期，單胺類信號擾動可改變攻擊性[9]。單胺類神經遞質在非典型抑郁癥和抑郁癥的亞型中有不同的影響[10]。

5-HT是一種抑制性神經遞質，參與對情感、睡眠、警覺、食欲、記憶等多種生理功能的調節，還可對體溫、鎮痛及心血管功能產生影響，作用的不同可能與其釋放后結合的受體不同相關。功能失調性5-HT的節律可能是抑郁癥的一種常見的端點和生物標志物[10]。目前認為在應激狀態下動物腦內可出現5-HT更新加速的現象；而在腦內的5-HT活性降低時，機體對各種應激刺激的敏感性則會增加，從而易受傷害以致引起多種精神癥狀。Azmitia等[11]認為，在應激狀態下下丘腦-垂體-腎上腺皮質(HPA)軸功能亢進，增高的糖皮質激素則通過誘導肝臟中的色氨酸吡咯化酶，降解血漿中的色氨酸，從而調整中樞的色氨酸不足及5-HT合成低下。當5-HT功能過度低下時，HPA軸過度亢進，糖皮質激素的升高會造成大腦的損傷，進而導致了情緒低落、興趣減退等抑郁癥狀的發生；同樣，當HPA軸功能不足時，也會導致5-HT的功能低下。大量研究表明NE與情志活動有密切關系，NE不但可以作為肝郁證動物模型的反證指標之一，而且也是探討肝郁導致精神情志異常的機理的主要指標之一。當NE系統功能紊亂時，對應激適應的失敗則可導致焦慮和抑郁癥狀[12]。魯明等[13]用夾鼠尾法建立肝郁證大鼠模型，檢測正常組、模型組及柴胡疏肝散治療組的大鼠腦干NE的變化，結果發現模型組大鼠腦干的NE含量明顯升高。DA既是NE的前體，又是一種重要的獨立神經遞質。中腦DA能神經元對軀體運動有調節作用，對垂體內分泌功能和心血管功能有一定調節作用，還參與神經活動的調節，尤其是中腦邊緣皮質DA系統在情緒和精神活動中發揮重要作用。

本研究結果表明：模型組大鼠的行為學發生了明顯變化，海馬及下丘腦中的5-HT、5-HIAA、DA含量均下降，NE含量呈增加趨勢，而柴胡疏肝散能調控肝郁證大鼠腦5-HT、5-HIAA、NE、DA變化趨勢，從而有效發揮抗肝郁作用。以上實驗結果說明，肝郁證模型大鼠海馬及下丘腦的單胺類神經遞質5-HT、5-HIAA、DA、NE，與對照組、治療組相比呈現出不同的變化特點，說明肝的疏泄功能與5-HT、5-HIAA、DA及NE有關；柴胡疏肝散抗肝郁作用可能與調控5-HT、5-HIAA、DA及NE等單胺類神經遞質有關。

綜上所述，柴胡疏肝散能有效改善肝郁證模型大鼠的行為學變化，對其海馬及下丘腦單胺類神經遞質有調控作用。柴胡疏肝散等中藥復方治療情志類疾病臨床療效顯著，但其作用機制尚未明確，并不局限于對單胺類神經遞質的調控，值得進一步探討。

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(本文編輯郭懷印)

Effects of Chaihu Shugan Power on the Levels of Monoamine Neurotransmitters in the Hippocampus and Hypothalamus in Rats with Liver-qi Stagnation Syndrome

Ma Yufeng,Wang Jialing,Xing Jia,Zhu Xiaochen,Yue Guangxin,Wang Yulai,Guo Rongjuan,He Lijuan

Third Affiliated Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China

He Lijuan (Dongfang Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing,China)

Objective To study the effects of Chaihu Shugan powder (CSD) on the ethological changes and levels of monoamine neurotransmitters in the hippocampus and hypothalamus in rats with liver-qi stagnation syndrome.Methods The rat model with liver-qi stagnation syndrome was established by chronic restraint stress and keeping them alone.Each rat was reviewed by Open-field test,Sucrose test and determined the levels of monoamine neurotransmitters in the hippocampus and hypothalamus by high performance liquid chromatography (HPLC).Results The ethological manifestation of model rats was changed obviously,and the levels of 5-hydroxytryptamine (5-HT), 5-hydroxyindoleacetic acid (5-HIAA),dopamine(DA) in the hippocampus and hypothalamus were decreased,while the level of norepinephrine (NE) was increased.CSD could regulate its trends.Conclusion CSD can improve the model rat’s ethological manifestation and have therapeutic effects of liver-qi stagnation syndrome.The mechanism may be adjust the levels of 5-HT,5-HIAA,NE,DA in rat brain with liver-qi stagnation syndrome,in order to effectively play the role of anti-liver-qi stagnation.

liver-qi stagnation syndrome;Chaihu Shugan power; monoamine neurotransmitters; 5-hydroxytryptamine; 5-hydroxyindoleacetic acid;dopamine

國家自然科學基金資助項目(No.30973706)；賀立娟青年教師專項(No.2013-QNJSZX016)

1.北京中醫藥大學第三附屬醫院(北京 100029)；2.北京中醫藥大學東方醫院；3.中國中醫科學院

賀立娟，E-mail：ljhebj@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.21.008

1672-1349(2016)21-2494-04

2016-07-21)

引用信息：馬玉峰，王嘉麟，邢佳，等.柴胡疏肝散對肝氣郁結證大鼠海馬及下丘腦單胺類神經遞質的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2016，14(21)：2494-2497.