典型抗生素與群體感應抑制劑對費氏弧菌的三元慢性聯合毒性

方章順，姚志峰，王婷，林志芬，左勝鵬,*

1. 安徽師范大學環境科學與工程學院，蕪湖 241002 2. 同濟大學環境科學與工程學院，上海 200092

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典型抗生素與群體感應抑制劑對費氏弧菌的三元慢性聯合毒性

方章順1，姚志峰2，王婷2，林志芬2，左勝鵬1,*

1. 安徽師范大學環境科學與工程學院，蕪湖 241002 2. 同濟大學環境科學與工程學院，上海 200092

群體感應抑制劑(quorum sensing inhibitor, QSIs)廣泛應用之后與環境中現有抗菌藥物共存的趨勢不可避免。為了評價QSIs和現有抗菌藥物共存所引起的生態環境效應，本文以費氏弧菌(Vibrio fischeri)作為模式生物，磺胺類抗生素磺胺氯噠嗪(SCP)、磺胺類增效劑甲氧芐嘧啶(TMP)和群體感應抑制劑4-溴-5-溴亞甲基-2(5氫)-呋喃酮(FC-30)為研究對象，測定了以上3個化合物對Vibrio fischeri的單一/混合慢性毒性效應。單一慢性毒性結果表明，3個化合物的毒性大小如下：FC-30

抗生素；群體感應抑制劑；費氏弧菌；三元混合；慢性毒性；聯合毒性

Received 2 November 2015 accepted 30 November 2015

抗生素自發現以來，因其對病原微生物的特異性，進而無節制大量使用[1]。隨著抗生素使用量的逐漸增加，全球每年僅獸用抗生素的消費總量就達到100 000～200 000 t[2-3]。Thomas等[4]研究了全球抗生素用量的變化，結果顯示近十年來抗生素用量增加了36%，其中以中國為主的5個國家抗生素用量占增加的76%。抗生素濫用造成的抗性基因問題引起了廣泛關注[1-5]，尋找抗生素替代品是目前解決抗性基因的重要途徑。群體感應抑制劑(quorum sensing inhibitor, QSI)是目前提出較為理想的抗生素替代品?？筛蓴_細菌的群體感應，進而抑制細菌的生長。QSI與抗生素的聯合使用使得細菌對后者的敏感心增加，因此研究者可以嘗試用低劑量的抗生素和QSI聯合用藥，這可能會起到更好的效果。另外，如果QSI在未來大量使用，那它與抗生素在環境中共存的可能性極大，因此對QSI與抗生素聯合毒性進行研究是必要的，可為生態風險評價提供借鑒意義。

磺胺類抗生素(sulfonamides, SAs)在1937年被發現，因其對細菌具有廣譜抗菌性、療效高、廉價等優點成為最早系統性藥用的抗生素之一。磺胺類抗生素不易降解，屬于新型的POPs[6]。在選用抗菌藥物時，為了達到更好的療效，降低治療過程會產生的副作用，臨床醫生常常采用聯合用藥的方式。TMP是磺胺類抗生素常用的增效劑，臨床上常常聯合使用，因此二者在環境中聯合存在的可能性較高。呋喃酮類化合物是研究最早的QSI，被證實具有良好的群體感應效應的拮抗作用，能有效抑制生物膜的形成，有良好的抑菌效果[7]，未來被臨床上應用的可能性較大，一旦其進入環境中，必定與現有的SAs和TMP聯合存在。所以三者聯合毒性研究具有重要的現實意義。

本課題組前期對SAs和TMP的聯合毒性，以及SAs和QSI的聯合毒性進行了初步研究[8-14]，研究發現SAs和TMP的急性聯合效應為協同，慢性聯合效應為拮抗，并指出急慢性毒性過程中作用蛋白不同是導致聯合效應不同的根本原因。同時發現大部分呋喃酮類化合物與磺胺類抗生素的急性聯合毒性為協同作用。三元慢性毒性還未涉及，那么，QSI與抗生素的慢性聯合效應如何；在評價聯合毒性時，對環境的影響如何？這是本研究所關注和所要回答的問題。

費氏弧菌(Vibrio fischeri)作為典型的革蘭氏陰性菌，特別是作為抗生素及QSI的靶生物，在聯合毒性效應研究中已被廣泛應用[15-16]。本研究以Vibrio fischeri作為模式生物，以環境中常被檢測出的SCP、TMP及FC-30作為研究對象，測定了3種藥物對Vibrio fischeri的單一慢性毒性和三元混合慢性毒性，并回答聯合效應的原因，為環境生態風險評價提供科學依據。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 試劑與儀器

實驗使用化合物均購自Sigma-Aldrich化學制品有限公司(St. Louis, MO, USA)，具體試劑信息如表1所示。進行慢性毒性測試所用化合物配制使用助溶劑二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)，DMSO濃度均控制為1‰。

所用儀器及軟件：化學發光分析儀(BH9507，北京濱松光子技術股份有限公司)、高壓蒸汽滅菌鍋、精密電子天平(BT25，德國saryorius公司)、電子pH計(PH510，美國OAKTON公司)、超凈工作臺、全自動新型生化培養箱(ZSD-1430，上海智城分析儀器有限公司)、恒溫培養振蕩器、超聲波清洗器和恒溫鼓風干燥箱等。

表1 實驗用化合物名稱及結構

1.2 Vibrio fischeri慢性毒性測定

1.2.1 菌種及培養及配制

Vibrio fischeri凍干粉購自中國科學院南京土壤研究所。培養基選擇參照供應商提供的配方配制。菌液配制：在超凈工作臺中，取適量斜面三代菌種接入5 mL液體培養基，在22 ℃恒溫條件下培養至對數生長期(12～16 h)成為藥瓶菌液。取處于對數生長期的搖瓶菌液約0.2 mL，加入到20 mL的3%NaCl溶液中，磁力攪拌40 min后，此時菌液的發光強度平穩，即可將菌液用于毒性測定。

1.2.2 毒性試驗

本論文基于Microtox急性毒性測試原理[17]與水質急性毒性測定發光[18]細菌法進行毒性測試。在每一測試管中加入800 μL測試溶液(含預設濃度梯度待測化合物，不足800 μL部分使用2% NaCl溶液補齊)，振蕩1 min混勻。在上述測試溶液中加入200 μL工作菌液，統一振蕩1 min混勻。將加菌溶液于22 ℃恒溫條件下培養24 h，使用化學發光免疫分析儀(BHP9507)測定發光值。

1.2.3 毒性測試數據表征

化合物毒性用其對Vibrio fischeri的發光抑制率表述[19]，如式(1)所示：

其中，S表示測試樣的發光值，C表示空白平均發光值。

慢性聯合毒性采用指標(TU)來表征，其計算方法如式(2)所示：

TU=CA/EC50A+CB/EC50B

其中，CA和CB是混合體系半數抑制效應時單一污染物(A、B)在混合體系中的摩爾濃度(mol·L-1)；EC50A和EC50B分別是污染物單一污染時的半數效應濃度。

根據Broderius[20]的研究，當0.8TU1.2，認為兩組分間存在加和效應；當TU1.2表明組分間存在拮抗效應；當TU0.8意味著組分間存在協同效應。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 SCP、TMP和FC-30對Vibrio fischeri的單一慢性毒性

測定了SCP、TMP和FC-30對Vibrio fischeri的單一慢性毒性，結果如圖1所示。

圖1 SCP、TMP和FC-30對Vibrio fischeri單一慢性毒性Fig. 1 The single toxicity of SCP, TMP and FC-30 to Vibrio fischeri

圖2 SCP、TMP和FC-30等毒性比組成的三元混合物慢性聯合毒性Fig. 2 The tertiary mixture toxicity of SCP, TMP and FC-30 at equal toxic ratio

從圖1中可以看出，3種化合物對Vibrio fischeri單一慢性毒性均呈現hormesis效應，即低劑量促進高劑量抑制的雙向劑量效應關系。

此外，3種化合物的慢性毒性大小順序如下所示：FC-30(EC50=2.44×10-5mol·L-1)< SCP(EC50=7.78×10-6mol·L-1)

圖3 等毒性比組成的二元混合物慢性聯合毒性Fig. 3 The chronic mixture toxicity of binary mixture at equal toxic ratio

2.2 SCP、TMP和FC-30對Vibrio fischeri的三元聯合毒性作用

根據Lin等[21]提出的頂點假設理論可知，當化合物各組分以等毒性比(1:1:1)混合時，聯合效應最強。因此本文根據單一化合物的慢性毒性結果，在等毒性比的情況下，測定了SCP、TMP和FC-30三元混合物對Vibrio fischeri的慢性混合毒性，結果如圖2所示

從圖2可以看出，與單一毒性結果相似，三元混合物的慢性毒性也呈現hormesis效應。此外，根據公式(2)計算了混合體系的聯合效應，結果顯示TU為2.3，說明了三元混合物的聯合毒性效應為拮抗作用。

前期研究表明SAs和TMP的二元慢性聯合效應為協同，而本文研究表明SCP、TMP和FC-30的三元混合物的聯合效應為拮抗，那么三元混合物產生拮抗作用的原因是什么呢?

2.3 SCP、TMP和FC-30對Vibrio fischeri的二元聯合毒性作用

為了回答以上問題，以SCP、TMP和FC-30在三元混合體系中的濃度(CSCP=2.93×10-5mol·L-1，CTMP=3.72×10-6mol·L-1，CFC-30=9.76×10-5mol·L-1)為基礎，分別建立了相應的二元混合體系，即SCP+TMP，SCP+FC-30和TMP+FC-30，并測定了二元混合體系對Vibrio fischeri的慢性毒性，結果如圖3所示。

由圖3(a)可知，SCP和TMP在毒性比為1:1時，TU值為0.2，說明二者聯合呈現協同作用。而圖3(b, c)中，在毒性比1:1時，SCP+FC-30和TMP+FC-30兩個混合體系的最大抑制率未超過6%，這說明二者混合暴露的毒性小于單一化合物暴露毒性相加，即FC-30與SCP和FC-30與TMP的兩個混合體系的相互作用皆為拮抗。可見FC-30與SCP或TMP之間的拮抗作用是導致3種化合物聯合用藥時聯合效應為拮抗作用的根本原因。

那么，在聯合毒性評價中，應該考慮到在慢性毒性條件下，QSI和磺胺類抗生素聯合用藥時可能產生拮抗作用。

綜上可知：

(1)本文測定了SCP、TMP以及FC-30對Vibrio fischeri的單一慢性毒性，結果表明SCP、TMP和FC-30對Vibrio fischeri單一慢性毒性均呈現hormesis效應，毒性大小順序如下TMP>SCP>FC30。

(2)測定了SCP、TMP和FC-30對Vibrio fischeri的三元聯合慢性毒性，結果表明聯合效應為拮抗。并指出FC-30和SCP以及FC-30和TMP二元混合體系的拮抗作用導致了三元混合體系聯合作用為拮抗。

(3)在毒性評價中，FC-30與SCP或TMP聯合時具有拮抗作用，對環境的影響小。

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◆

Chronic Joint Toxicity of Sulfa Antibiotics and Quorum Sensing Inhibitors toVibriofischeri

Fang Zhangshun1, Yao Zhifeng2, Wang Ting2, Lin Zhifen2, Zuo Shengpeng1,*

1. College of Environmental Science and Engineering, Anhui Normal University, Wuhu 241002, China 2. College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China

Being promising antibiotic alternatives, quorum sensing inhibitors (QSIs) will unavoidably coexist with the existing antibiotic drugs after its wide application. To assess the joint toxicity of QSIs and existing antibiotic chemicals, sulfachloropyridazine (SCP), its synergist-trimethoprim (TMP) and furanone C-30 (FC30), a kind of QSIs) were selected as objects, and we determined their single/mixture chronic toxicity on Vibrio fischeri. The results showed that the order of single chronic toxicity was FC30 < SCP

antibiotics; quorum sensing inhibitors; Vibrio fischeri; tertiary mixture; chronic toxicity; joint toxicity

10.7524/AJE.1673-5897.20151102001

污染控制與資源化研究國家重點實驗室自主課題資助(PCRRK16007)；中國國家自然科學基金(201177092，21377096，21577105)；同濟大學“攀登”計劃(0400219287)；111項目，上海市科技委員會(14DZ2261100)資助；安徽師范大學2015度研究生科研創新與實踐項目

方章順(1991-)，男，碩士，研究方向為微生物毒理學，E-mail: 15801769917@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: whmzsp79@ahnu.edu.cn

2015-11-02 錄用日期：2015-11-30

1673-5897(2016)2-369-05

X171.5

A

簡介：左勝鵬(1979— )男，博士，教授，碩士生導師，主要從事環境生態學、入侵生態學、農業生態學等研究。

方章順, 姚志峰, 王婷, 等. 典型抗生素與群體感應抑制劑對費氏弧菌的三元慢性聯合毒性[J]. 生態毒理學報，2016, 11(2): 369-373

Fang Z S, Yao Z F, Wang T, et al. Chronic joint toxicity of sulfa antibiotics and quorum sensing inhibitors to Vibrio fischeri [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 369-373 (in Chinese)