3種典型有機氯農藥對錦鯉幼魚的雌激素效應及其體內富集

于瑞蓮，林承奇，林喜燕，胡恭任

華僑大學 化工學院，廈門 361021

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3種典型有機氯農藥對錦鯉幼魚的雌激素效應及其體內富集

于瑞蓮，林承奇，林喜燕，胡恭任

華僑大學 化工學院，廈門 361021

為研究3種典型有機氯農藥(α-六六六、p,p′-DDT和七氯)低濃度暴露對錦鯉幼魚的雌激素效應及其體內富集效應，將錦鯉幼魚暴露于有機氯農藥的6個濃度組中進行20 d慢性毒性試驗，測量血清中游離鈣和蛋白結合磷含量及體內各組織有機氯農藥殘留。結果表明，在低濃度暴露20 d后，錦鯉幼魚血清中游離鈣和蛋白結合磷含量均隨暴露濃度增加而呈先增后減之勢，產生了明顯的雌激素效應。p,p′-DDT在魚體各組織中的富集能力遠高于α-六六六和七氯；p,p′-DDT主要在魚油中富集，其次為魚肝、魚鰓和魚皮；α-六六六和七氯主要在魚肝中富集，其次為魚皮、魚鰓和魚油；3種有機氯農藥在魚肉中的富集相對較少。

有機氯農藥；錦鯉幼魚；雌激素效應；生物富集

有機氯農藥(OCPs)是具有持久性、高毒性和生物蓄積性的一類有機污染物，因其高效、廣譜而曾被廣泛應用于農牧漁業病蟲害的防治[1-2]。雖然目前OCPs在全球大部分國家和地區已禁止生產和使用，但因其在環境中不易分解、殘留期長而在不同環境介質中仍能被不同程度的檢出[3-5]。水生生態系統是許多污染物的匯，魚類是研究水環境污染常用的水生動物。

OCPs具有內分泌干擾作用，可通過與雌激素受體結合而影響動物的生殖和發育。卵黃蛋白原(VTG)作為檢測外源雌激素作用的生物標志物而被廣泛應用于環境激素的篩選與評價[6]。VTG是一種鈣結合脂磷蛋白，魚體血清鈣和磷含量會隨VTG增加而增加，且呈較好的相關性，因此可通過測定血清中游離鈣和蛋白結合磷含量的變化來間接反映VTG含量變化情況，以評價魚類受雌激素影響程度，并對化學物質的雌激素效應進行篩選和評價[7]。

本文以3種典型OCPs(α-六六六、p,p′-DDT和七氯)為研究目標化合物，以錦鯉幼魚為受試生物，通過測定錦鯉幼魚血清中的游離鈣(Ca2+)和蛋白結合磷(VTG-P)含量來間接反映VTG的變化趨勢，分析上述OCPs在低濃度暴露水平下對錦鯉幼魚的雌激素效應及其在魚體內各組織的富集情況，旨在為農藥類環境激素影響機制研究及生態效應數據庫的建立提供基礎數據。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 實驗材料與試劑

錦鯉幼魚購自當地水族館，體長(11.0±1.0) cm，體重(23.3±2.2) g，健康活潑。經5%食鹽水消毒后于水族箱中馴養10 d，馴養期間每天喂食1次，換水1次，錦鯉幼魚死亡率不超過5%。馴養及暴露實驗水質均符合漁業水質標準GB11607-89要求。

α-六六六、p,p′-DDT和七氯標準樣均購自農業部環境保護科研監測所，濃度100 μg·mL-1，介質為石油醚。石油醚(餾程60 ℃～90 ℃)和丙酮為色譜純。測定磷和鈣所用試劑均為分析純。

1.2 暴露實驗

根據聯合國環境規劃署規定的保護水生生物淡水中農藥最大允許濃度，按等對數間距設1個空白對照和5個低劑量濃度梯度暴露組。采用半靜態暴露實驗，實驗容器為Ф 35 cm×40 cm的塑料桶，每桶(裝4 L暴露溶液)放入5條錦鯉幼魚，暴露20 d后，測定血清中游離鈣和蛋白結合磷含量。為確保藥物濃度和溶解氧含量，每天更換25%的暴露溶液。暴露期間不喂食。

1.3 血清中游離鈣和蛋白結合磷含量測定

采用斷尾取血并離心后獲得錦鯉幼魚血清，用移液槍吸取0.5 mL血清至玻璃消化管中，加入5 mL混合消解液(V蒸餾水:V硝酸:V過氧化氫= 5:3:2)，于沸水浴中消煮60 min，冷卻后用1% HNO3溶液定容至25 mL，用火焰原子吸收分光光度法(AAS)測定鈣含量。另取0.5 mL血清，按林浩然等[8]的方法測定堿不穩定性蛋白結合磷。以上兩指標的消解及測定過程均做平行試劑空白。

1.4 魚體內農藥殘留量的測定

1.4.1 樣品制備

取上述實驗后的空白組與100 ng·L-1α-六六六、20 ng·L-1p,p′-DDT、80 ng·L-1七氯暴露組的幼魚用于測定魚體各組織的農藥殘留。將同一暴露組5條魚的同種器官或組織混合為1個樣品，分別制備成魚肉、魚頭、魚皮、魚鰓、魚油和魚肝等組織的樣品。經洗凈，濾紙擦干后稱濕重，裝入塑料離心管中，用紗布封口后于冷凍干燥儀中于-80 ℃下冷凍干燥24 h。取出干燥好的樣品稱其干重，并用研缽研磨成固體粉末，密封后放入干燥器內保存備用。

1.4.2 樣品提取與凈化

將各組織樣品粉末倒入250 mL錐形瓶中，加入15 mL丙酮和15 mL石油醚混勻，置于40 ℃超聲水浴中提取15 min，靜置后取澄清液轉移到另一250 mL錐形瓶中，再次加入10 mL丙酮和10 mL石油醚至有沉渣的錐形瓶中超聲提取15 min，合并2次提取液并用中性濾紙過濾，濾液用旋轉蒸發儀濃縮至近干，用石油醚轉移到具塞比色管中，定容至5 mL，加入1 mL濃硫酸，蓋上試管塞，振搖1 min，以6 000 r·min-1離心10 min，用移液槍小心吸取上清液1 mL至樣品瓶中，供氣相色譜分析用。

1.4.3 氣相色譜分析

OCPs定量分析在Agilent 6890N型氣相色譜儀上進行，檢測器為微池電子捕獲電測器(μ-ECD)，溫度320 ℃，色譜柱為石英彈性毛細管柱 HP-5 (30.0 m×320 μm×0.25 μm)，載氣為高純氮氣，流速3 mL·min-1，進樣口溫度220 ℃，柱溫程序：80 ℃保持1 min，然后以30 ℃·min-1的速度升至180 ℃，再以3 ℃·min-1的速度升至205 ℃，保持4 min，最后以20 ℃·min-1升至290 ℃，保持2 min。進樣量為1 μL，不分流進樣。

1.4.4 方法精密度與加標回收率

配制上述3種OCPs的低濃度標準工作液，以3倍信噪比計算方法檢測限，其最低檢測限為0.002～0.005 mg·L-1；實驗分別對3種OCPs標準工作液進行3次平行測定，其相對標準偏差≤5.88%；每批樣品測定時，同時做標準曲線、空白樣品和加標回收實驗，方法加標回收率為106%～109%，均符合EPA對回收率要求。

2 結果(Results)

2.1 錦鯉幼魚血清中游離鈣和蛋白結合磷含量

錦鯉幼魚在低濃度的3種典型有機氯農藥溶液中暴露20 d，暴露期間，錦鯉幼魚均無死亡。暴露20 d后，錦鯉幼魚血清中游離鈣和蛋白結合磷的含量見圖1。錦鯉幼魚血清中游離鈣和蛋白結合磷的含量總體上隨暴露劑量升高呈先升高而后又降低的變化趨勢。α-六六六暴露實驗中，錦鯉幼魚血清中游離鈣含量范圍40～184 mg·L-1，蛋白結合磷含量范圍72～217 mg·L-1，兩者的最高值均出現在50 ng·L-1暴露組；p,p′-DDT暴露實驗中，錦鯉幼魚血清中游離鈣含量范圍61～253 mg·L-1，蛋白結合磷含量范圍103～301 mg·L-1，兩者的最高值均出現在10 ng·L-1暴露組；七氯暴露實驗中，錦鯉幼魚血清中游離鈣含量范圍80～230 mg·L-1，蛋白結合磷含量范圍198～406 mg·L-1，兩者的最高值均出現在40 ng·L-1暴露組。

2.2 錦鯉幼魚各組織中有機氯農藥殘留量

分別于100 ng·L-1α-六六六、20 ng·L-1p,p′-DDT和80 ng·L-1七氯中暴露20 d后的錦鯉幼魚各組織器官中3種有機氯農藥含量見表1。各組織中α-六六六含量范圍20.93～964.9 ng·g-1，含量大小順序為魚肝>魚皮>魚鰓>魚油>魚頭>魚肉；各組織中p,p′-DDT含量范圍41.88～10 329 ng·g-1，含量大小順序為魚油>魚肝>魚鰓>魚皮>魚頭>魚肉；各組織中七氯含量范圍5.989～3 536 ng·g-1，含量大小順序為魚肝>魚皮>魚鰓>魚油>魚頭>魚肉。

圖1 低濃度有機氯農藥暴露20 d后錦鯉幼魚血清中游離鈣和蛋白結合磷含量Fig. 1 Contents of Ca2+ and VTG-P in the serum of juvenile Cyprinus carpio after low concentration exposure to OCPs for 20 d

表1 低濃度暴露20 d后3種有機氯農藥在錦鯉幼魚各組織中的含量

3 討論(Discussion)

3.1 三種有機氯農藥對錦鯉幼魚的雌激素效應

VTG是由性成熟雌魚肝臟合成的一種特異性蛋白，為正在發育的胚胎提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、維生素等營養及功能性物質[9]。VTG的順利合成需要有雌激素的誘導，一般認為，性成熟的雌性卵生脊椎動物可合成大量VTG，而幼魚肝臟中也具有雌激素受體(ER)的基因，但由于缺少雌激素的刺激，因而不能生成VTG。已有研究表明，當雄魚或幼魚受到外源性低劑量的類雌激素刺激，能誘導體內VTG的生成[10]。本研究錦鯉幼魚暴露于低濃度的上述3種典型OCPs中20 d后，血清中游離鈣和蛋白結合磷的含量總體上先隨暴露濃度的升高而升高，而后又降低，呈現倒U字型的變化趨勢。根據李云等[7]的研究，VTG是一種鈣結合脂磷蛋白，在卵黃發生的雌體血漿中能檢測出高水平的蛋白結合磷，測定蛋白結合磷也就間接測定了VTG含量。同時，根據趙兵等[11]的研究，對于同種魚，血清中鈣和磷含量隨VTG含量的增加而增加，且呈較好的相關性。因此，錦鯉幼魚血清中游離鈣和蛋白結合磷含量呈現倒U字型的變化趨勢間接反映了VTG的含量呈現倒U字型的變化趨勢。環境內分泌干擾物的作用特點之一是劑量-反應曲線并不具有線性特征，即剛開始反應隨暴露濃度上升而增強，達到最大反應值后，暴露濃度上升反而會導致生物反應減弱[12]。本研究結果與環境內分泌干擾物的作用特點相符。可見，α-六六六、p,p′-DDT和七氯這3種典型OCPs對錦鯉幼魚表現出較明顯的雌激素效應。

錦鯉幼魚血清中游離鈣和蛋白結合磷含量隨暴露濃度升高而先升高后降低的現象可能是由于過量吸收農藥引起機體傷害所致。許多研究表明，在正常情況下魚體內超氧化物歧化酶(SOD)活性和活性氧自由基(ROS)的含量會達到一定的動態平衡，當生物體受到輕度逆境脅迫時，魚體內產生過量的ROS可誘導SOD活性提高，清除自由基的能力相應增強，對肝細胞的毒性損害較小；而當受到重度逆境脅迫時，SOD活性通常降低，使生物體內積累了過量的活性氧，抑制了酶的活性[13]，破壞了細胞的正常代謝，對肝細胞產生了較大的損害，阻礙了肝臟中VTG的合成，從而導致了血清中游離鈣和蛋白結合磷含量的下降。

3.2 三種有機氯農藥在錦鯉幼魚各器官的分布與富集

研究發現，某些化學品劑量雖屬于急性和慢性毒性測試標準規定的生物安全水平，卻能在水生生物體內富集至較高濃度，并通過食物鏈對其他生物產生危害，例如OCPs在魚體內富集，導致以魚為食的鳥類的減少[14]。從錦鯉幼魚各組織中3種典型OCPs殘留量測定結果(表1)可知，上述3種OCPs在魚體各組織中有不同程度的富集。

生物富集效應通常用富集系數表示，即富集系數(BCF)=魚體組織中的含量(mg·kg-1)/試驗液中農藥的濃度(mg·L-1)[15]。3種有機氯農藥的富集系數如圖2，α-六六六主要在魚肝、魚皮、魚鰓和魚油中富集，富集系數分別為9 649、3 572、3 077和1 265；p,p′-DDT主要在魚油、魚肝、魚鰓和魚皮中富集，富集系數分別為516 450、340 350、97 550和89 800；七氯主要在魚肝、魚皮、魚鰓和魚油中富集，富集系數分別為44 210、3 993、3 493和2 496。3種有機氯農藥在魚肉中的富集相對較少。

圖2 低濃度暴露20 d后錦鯉幼魚各組織中3種有機氯農藥的富集系數Fig. 2 BCFs of three OCPs in the tissues of juvenile Cyprinus carpio after low concentration exposure for 20 d

同種有機氯農藥在錦鯉幼魚各組織中的富集程度不同，魚肝表現出高富集主要是因為肝臟是有機氯農藥作用的靶器官之一，同時也與肝臟的解毒和代謝機制有關；魚油的高富集是因為其脂肪含量高，而有機氯農藥的脂溶性特征使其極易在生物體內積累，且蓄積庫為脂肪組織[16]；魚皮和魚鰓的高富集是因為魚皮和魚鰓與水環境直接接觸，可直接從水環境中富集OCPs[17]。

不同有機氯農藥在魚體內各組織的富集程度不同，其中p,p′-DDT的富集能力遠高于α-六六六和七氯，這與有機氯農藥的正辛醇-水分配系數有關。有機氯農藥在生物體內的富集程度與其正辛醇-水分配系數具有正相關性[18]。查詢《有機化合物環境數據簡表》可知，α-六六六、p,p′-DDT和七氯的正辛醇-水分配系數的對數分別為3.8、6.91和6.10，與富集程度結果較相符。

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Eestrogen Effect and BioaccumulationinVivoof Three Typical Organochlorine Pesticides on JuvenileCyprinuscarpio

Yu Ruilian*, Lin Chengqi, Lin Xiyan, Hu Gongren

College of Chemical Engineering, Huaqiao University, Xiamen 361021, China

Received 27 October 2015 accepted 22 December 2015

Juvenile Cyprinus carpio was chosen as the tested aquatic animal and exposed to six different concentrations of three typical organochlorine pesticides (OCPs) (α-benzenehexachlorid, p,p′-DDT and heptachlor) for 20 d chronic toxicity test to study the estrogen effect and bioaccumulation of the OCPs. After the exposure test, the concentrations of free calcium and protein-bound phosphorus in the serum of Cyprinus carpio and the residual OCPs contents in vivo were determined. The results demonstrated that the contents of free calcium and protein-bound phosphorus in the serum of juvenile Cyprinus carpio increased first and then decreased with the exposure concentration after low concentration exposure for 20 days. This phenomenon indicated that the above three OCPs presented obvious estrogen effect on the juvenile Cyprinus carpio. The bioaccumulation of p,p′-DDT in different tissues of the juvenile Cyprinus carpio was far higher than those of α-benzenehexachlorid and heptachlor. p,p′-DDT was mostly accumulated in the oil, followed by liver, gills and skin, while α-benzenehexachlorid and heptachlor were mostly accumulated in the liver, followed by skin, gills and oil. The accumulation of above three OCPs in the muscle of juvenile Cyprinus carpio was relatively less.

organochlorine pesticides; juvenile Cyprinus carpio; estrogen effect; bioaccumulation

10.7524/AJE.1673-5897.20151027002

福建省自然科學基金項目(2007J017)；華僑大學研究生科研創新能力培育計劃資助項目(423)

于瑞蓮(1970-)，女，博士，研究方向為環境污染化學，E-mail: ruiliany@hqu.edu.cn

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: ruiliany@hqu.edu.cn

2015-10-27 錄用日期：2015-12-22

1673-5897(2016)2-3748-06

X171.5

A

簡介：于瑞蓮(1970—)，女，環境科學博士，教授，主要研究方向環境污染化學，發表學術論文50余篇。

于瑞蓮, 林承奇, 林喜燕, 等. 3種典型有機氯農藥對錦鯉幼魚的雌激素效應及其體內富集[J]. 生態毒理學報，2016, 11(2): 374-379

Yu R L, Lin C Q, Lin X Y, et al. Eestrogen effect and bioaccumulation in vivo of three typical organochlorine pesticides on juvenile Cyprinus carpio [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 374-379 (in Chinese)