冶煉企業周邊農田土壤的多環芳烴污染及其細菌群落效應

吳宇澄，林先貴,，朱清禾，曾軍，丁慶旻

1. 中國科學院南京土壤研究所 土壤與農業可持續發展國家重點實驗室，南京 210008 2. 中國科學院南京土壤研究所-香港浸會大學土壤與環境聯合開放實驗室，南京 210008

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冶煉企業周邊農田土壤的多環芳烴污染及其細菌群落效應

吳宇澄1,2，林先貴1,2,，朱清禾1,2，曾軍1,2，丁慶旻1,2

1. 中國科學院南京土壤研究所 土壤與農業可持續發展國家重點實驗室，南京 210008 2. 中國科學院南京土壤研究所-香港浸會大學土壤與環境聯合開放實驗室，南京 210008

多環芳烴是一類持久性有機污染物，進入土壤后可能產生多方面生態效應。為研究多環芳烴對土壤微生物的影響，選取南京某冶煉企業周邊農田樣品，在分析污染物含量基礎上，采用高通量測序、定量PCR等方法綜合評價了土壤細菌多樣性和組成以及多環芳烴降解細菌豐度等特征。17個土壤樣品中，多環芳烴總量為0.25 ～ 31.08 mg·kg-1，并具有隨污染源距離增加而降低的空間分布特征。與土壤理化性質如pH相比較，多環芳烴污染對土壤細菌的總體多樣性和群落組成影響不顯著。進一步分析發現多環芳烴與潛在降解微生物的相對豐度和降解功能基因(芳香環羥基化雙加氧酶，PAH-RHDα)拷貝數顯著正相關。污染較重樣品的克隆、測序分析表明，土壤中PAH-RHDα基因主要屬于革蘭氏陽性細菌nidA3/fadA1類群，且與分支桿菌相關序列較為接近。這些結果綜合評價了冶煉企業周邊農田土壤多環芳烴污染對微生物群落的影響，提示土壤污染在多環芳烴潛在降解細菌中的富集作用，將為后續污染土壤生物修復提供重要科學依據。

多環芳烴；土壤細菌；芳香環羥基化雙加氧酶；分枝桿菌；群落效應

Received 26 October 2015 accepted 16 November 2015

多環芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是一類具有稠合苯環結構的有機污染物，主要來自化石燃料，特別是煤的燃燒、車輛尾氣以及一些生物質燃燒過程[1]。工業排放是環境中多環芳烴的重要來源，可導致附近農田土壤的污染[2-3]，并進而通過食物鏈傳遞導致人體健康風險。

多環芳烴對土壤生態系統具有廣泛的影響，如引起土壤動物死亡[4]，抑制植物生長[5]，損害土壤功能如硝化等[6]。微生物作為土壤生態系統中廣泛存在、最為活躍的組成部分，和PAHs污染物之間存在復雜的相互作用。一方面，PAHs污染具有微生物群落效應，體現為對土壤微生物多樣性、組成及生理功能的潛在影響[7-8]，反映污染物對微生物的潛在毒害效應；另一方面，部分微生物可通過多種酶學機制如芳香環羥基化雙加氧酶(PAH ring-hydroxylating dioxygenase, PAH-RHD)等轉化PAHs[9]，是控制土壤有機污染物的關鍵因素。但是，目前對PAHs土壤微生物群落效應的認識，多基于極端污染情況[10]，未考慮污染物的老化過程[7]，不能反映一般污染條件下的微生物響應規律。

冶煉企業是重要的多環芳烴工業排放源，其周邊土壤往往存在PAHs污染[11]。本研究系統采集南京市郊某冶煉企業周邊農田土壤，測定污染物含量，采用高通量測序和定量PCR方法深入解析土壤細菌群落多樣性和組成，并分析潛在PAHs降解細菌的響應情況。研究的主要目的在于分析工業排放導致農田土壤PAHs污染的微生物群落效應，其結果將為評價PAHs的微生物生態毒性以及污染土壤生物修復提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 樣品采集

南京市郊某大型冶煉企業，其煉焦、熱電等生產部門產生的廢氣排入大氣，是潛在的多環芳烴排放源。該企業東、南方主要為農田，受到大氣沉降的影響，存在一定污染風險。以廠區為起點，在該區域盛行下風向沿偏東、偏南兩個方向開展采樣，共設置17個樣點(MS-1～MS-17，圖1)。其中，MS-1、MS-2最接近潛在污染源(熱電廠煙囪，約500 m)；偏南方向包括MS-3至MS-10，最遠處距污染源約5 km；偏東方向包括MS-11至MS-17，最遠處距污染源約4.5 km。各采樣點均為蔬菜地。采樣于2014年12月進行，采用手動土壤采樣器按5點采樣法收集5 m×5 m范圍內表層農田土壤(0～10 cm)，充分混勻成為一個混合土樣。土樣一部分經風干、磨細后用于PAHs及理化性質分析，另一部分置于-20 ℃保存，用于微生物生態研究。

圖1 冶煉企業周邊采樣點分布Fig. 1 Soil sampling sites around the steel plant

1.2 土壤理化性質測定

采用酸度計測定土壤的pH值(水土比5:1)；標準方法分析土壤總碳、總氮、全磷、全鉀[12]；采用2 mol·L-1KCl溶液提取土壤無機氮(銨態氮、硝態氮)，流動分析儀(SKALAR)測定。

1.3 土壤多環芳烴的提取與分析

測定土壤中15種USEPA優先控制多環芳烴的含量，即萘、苊、芴、菲、蒽、熒蒽、芘、苯并[a]蒽、屈、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[a]芘、茚并[1,2,3-cd]芘、二苯并蒽和苯并[g, h, i]苝。具體方法為：稱取10 g干土，用60 mL二氯甲烷在索氏裝置上提取24 h，30 ℃旋轉蒸干。加入2 mL環己烷溶解，取0.5 mL溶解液過硅膠柱，加入正己烷/二氯甲烷混合液(1:1)洗脫。洗脫液經氮氣吹干，用乙腈溶解并定容至5 mL。

采用超快速液相色譜(島津UFLC-20系統)檢測土壤多環芳烴的含量。流動相為乙腈/水混合液，流速為0.8 mL·min-1，柱溫40 ℃。分離柱為反相Waters C18-PAH專用柱(4.6 mm×250 mm，粒徑5 μm)，熒光檢測器檢測。

1.4 土壤DNA提取

采用FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒(MP Biomedicals)提取土壤DNA，微量分光光度計(NanoDrop 2000)和電泳法檢測DNA的質量。為避免共提取的土壤腐殖質等雜質干擾PCR反應，DNA提取液經10倍稀釋后用于下游分析。

1.5 細菌16S rRNA基因高通量測序及數據分析

采用通用引物519F和907R擴增細菌16S rRNA基因片段。正向引物序列中包含5 bp的條形碼(barcode)序列。PCR反應體系為50 μL，包括25 μL Taq DNA聚合酶預混液(Takara), 1 μL模板(約50 ng基因組DNA)，1 μL正向及反向引物，23 μL ddH2O。PCR擴增條件為95 ℃ 3 min；95 ℃ 45 s, 56 ℃ 45 s, 72 ℃ 60 s，35個循環；72 ℃ 7 min。PCR產物經純化后，構建測序文庫，采用Illumina MiSeq系統進行雙向高通量測序。

基于QIIME分析平臺進行高通量數據分析。序列經拼接、比對后在97%相似性水平劃分操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)，在此基礎上計算多樣性指數，包括observed species，Chao1，Phylogenetic Diversity (PD)，Shannon和Simpson多樣性指數等；通過與Greengene database數據庫比較確定序列的系統學分類。

1.6 PAH-RHDα基因定量PCR分析

參照文獻報道方法[13]，采用定量PCR方法測定各樣品革蘭氏陽性和陰性細菌PAH-RHDα基因的拷貝數。定量PCR標準品的制備方法為：克隆目標基因(具體方法見1.7)，提取質粒后測定濃度并計算拷貝數，梯度稀釋制備標準曲線(拷貝數范圍107～101μL-1)。定量PCR標準曲線R2>0. 99，擴增效率>80%。

定量PCR采用Sybr Green方法，總反應體系為25 μL，包含12.5 μL TransStart Green qPCR SuperMix(全式金)，2 μL土壤DNA和10 pmol引物。反應程序為三步法：95 ℃預變性3 min；94 ℃ 15 s，55℃退火 45 s，95℃延伸30 s并讀取熒光信號，共進行40個循環；隨后進行熔解曲線分析和電泳評價擴增單一性。

1.7 革蘭氏陽性細菌PAH-RHDα基因克隆、測序與序列分析

PCR擴增革蘭氏陽性細菌的PAH-RHDα基因，經割膠純化后克隆至pEASY-T1載體，并轉化感受態大腸桿菌。根據菌落顏色隨機挑選陽性克隆并測序，所獲序列經去除載體和引物部分后，用Mothur軟件進行比對和劃分操作分類單元。采用MEGA6軟件，以Maximum likelihood (ML)方法重建PAH-RHDα基因的系統發育樹。

1.8 數據分析

用SPSS13.0進行相關性分析，雙側檢驗判斷顯著性；CANOCO 4.5軟件進行典范對應分析(canonical correspondence analysis, CCA)。

2 結果(Results)

2.1 土壤理化性質

土壤理化性質分析結果如表1所示。由各因子變異系數可見，17個樣品的全磷、銨態氮、硝態氮和PAHs總量性質存在較大差異，而總碳、總氮、碳氮比和全鉀總體變化不大。pH值的變化幅度為4.74～7.66，表現出較高的土壤酸堿性差異。

2.2 土壤PAHs含量及組成特征

所有土壤樣品中均檢出多環芳烴，15種PAHs總量(Σ15PAHs)為0.25～31.08 mg·kg-1(表1)。最靠近排放源的MS-1和MS-2中，Σ15PAHs接近7 mg·kg-1。隨著距離增加，土壤PAHs含量迅速降低。在偏東方向，Σ15PAHs由MS-11的1.72 mg·kg-1逐漸降至MS-15至MS-17的0.30 mg·kg-1左右；在偏南方向，除MS-9外，PAHs總量處于0.51～0.96 mg·kg-1之間。所有樣品中，MS-9的PAHs總量最高，達31.08 mg·kg-1。

圖2 熒蒽/(熒蒽+芘)和茚并[1,2,3-cd]芘/(茚并[1,2,3-cd]芘+苯并[g,h,i]苝)的十字交叉圖 注：多環芳烴比值范圍參照文獻[14-15]。Fig. 2 Cross plot of Fla/(Fla+Pyr) and IcdP/(IcdP+BghiP) ratio Note: The diagnostic ratios are referred to [14-15].

表1 各樣點土壤基本性質及多環芳烴含量

按環數統計PAHs組成，接近污染源樣品(MS-1和MS-2)和偏南方向樣點(MS-3至MS-10)中均以4環及以上PAHs為主，偏東部分樣點中三環及以下的低環組分比例較高(表1)。計算熒蒽/(熒蒽+芘)(Fla/(Fla+Pyr))和茚并[1,2,3-cd]芘/(茚并[1,2,3-cd]芘+苯并[g,h,i]苝)(IcdP/(IcdP+BghiP))比值，并作十字交叉圖(圖2)。圖中大部分樣點聚為一群，體現出煤炭及化石燃料燃燒的特征；偏南方向5個樣點(MS-5，MS-7至MS-10)明顯偏離，其中MS-9部分呈現石油源特征。

2.3 土壤細菌群落多樣性與組成

17個土壤樣品共獲得22.5萬余條16S rRNA基因序列，各樣品序列數為8 786～20 433條。基于OTU計算各樣品多樣性指數并與環境因子作相關分析，結果顯示PAHs與細菌多樣性指數間無顯著相關性，在土壤因子中僅有pH與各多樣性指數間存在顯著正相關(表2)。

各土壤在門水平的細菌群落組成如圖3所示。該區域農田土壤的優勢細菌有變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)等。CCA排序圖中，第一和第二排序軸共解釋32.3%的群落變異，pH和總磷兩個因子對細菌組成影響顯著(P<0.05)。MS-9與MS-5的細菌群落組成與其他樣點分異較大，pH中性的土壤MS-1、MS-2、MS-3、MS-4、MS-10聚在一起，位于CCA圖的右側，而其他更偏酸性的土壤則聚集在圖中的左側。

在屬的水平，與Σ15PAHs顯著正相關(P<0.05)，且至少一個樣品中相對豐度在0.5%以上的細菌有12個，其中已有文獻報道具有PAHs降解能力的是分枝桿菌(Mycobacterium)[16]、紅球菌(Rhodococcus)[17]、Actinomadura[18]、Nocardioides[19]等4個。如果排除PAHs總量異常偏高的MS-9，則僅有分枝桿菌的相對豐度與Σ15PAHs顯著正相關(圖5a)。

表2 多樣性指數與土壤性質及多環芳烴總量間的相關性

注：*和**分別表示顯著(P<0.05)和極顯著相關(P<0.01)。

Note: * and ** indicate significance at the level of P<0.05 and P<0.01, respectively.

圖4 細菌和環境因子的CCA分析Fig. 4 Canonical correspondence analysis of bacterial community in PAHs-contaminated soils

2.4 PAH-RHDα基因豐度和組成

定量PCR檢測中，各樣品中革蘭氏陰性菌均低于檢測限。革蘭氏陽性菌PAH-RHDα基因擴增產物經熔解曲線和電泳分析為單一峰(條帶)，表明實驗結果不受引物二聚體或非特異擴增的影響。17個土壤樣品中，革蘭氏陽性菌PAH-RHDα基因拷貝數范圍為每克干土0.39×104～1.6×105拷貝，并與土壤中的多環芳烴總量顯著正相關(圖5b)。

選擇PAH-RHDα基因豐度較高的MS-1、MS-2 和MS-9樣品進行基因克隆和測序分析，共獲得55個序列，經序列比對后在95%相似性劃分為4個OTU，其中OTU-1和OTU-2占所獲序列的91%。在系統發育樹上，這些序列與分支桿菌M. vanbaalenii和M. rhodesiae的nidA3B3基因最為接近，同屬于雙加氧酶的nidA3/fadA1類群(圖6)。

圖5 PAHs含量與(a)分支桿菌相對豐度和(b)革蘭氏陽性細菌PAH-RHDα基因豐度的關系Fig. 5 Correlations between PAHs concentration and (a) relative abundance of Mycobacterium and (b) copies of GP PAH-RHDα gene

圖6 三個土壤中革蘭氏陽性細菌PAH-RHDα基因的系統發育樹 注：本研究所獲序列以RHDα OTU開頭，括號中數字為OTU包含序列數。Fig. 6 Maximum likelihood tree of GP bacterial PAH-RHDα gene recovered from MS-1, MS-2 and MS-9 Note: The sequences recovered in this study begin with RHDα OTU. The numbers in the parentheses represent the number of sequences comprising the OTU.

3 討論(Discussion)

3.1 冶煉企業周邊農田土壤PAHs污染特征

本研究涉及17個農田樣點，距離污染源(熱電廠煙囪)距離從數百米至5 km不等。所有受試土壤中均檢出PAHs，含量變異較大。根據加拿大、荷蘭等國家現行土壤環境質量標準，接近排放源樣品中有4個(MS-1，MS-2，MS-3和MS-11)苯并[a]芘含量超出限定值(>0.1 mg·kg-1)；以總量計算，接近排放源的樣品(MS-1至MS4，MS-11和MS12)接近或超過1 mg·kg-1(表1)，污染程度相對較高。隨著距離的增加，PAHs總量迅速降低至1 mg·kg-1以內，呈現由近及遠污染程度下降的趨勢。高污染土壤的Fla/(Fla+Pyr)比值接近燃煤特征值[15](圖2)。由于研究區域內沒有其他高能耗企業或大量民用煤炭消耗，因此，該冶煉企業的排放可能是鄰近農田土壤PAHs污染的主要原因。根據IcdP/(IcdP+BghiP)比值，偏東及偏南方向部分樣品PAHs具有化石燃料燃燒特征[15]，這可能與這部分樣點臨近公路，受到車輛排放影響有關。MS-9樣品除PAHs總量外，苯并[a]芘含量高達4.0 mg·kg-1，是調查中所發現污染最嚴重的樣點，由于其遠離冶煉企業，具體污染源尚待進一步調查。

3.2 多環芳烴對土壤細菌群落的影響

高濃度多環芳烴污染土壤可以顯著改變微生物的多樣性[20]、群落組成[7]和生理活性[8]。但在農田生態系統中，PAHs污染程度一般遠低于前述研究[21-22]；PAHs與土壤的相互作用影響其賦存形態，將導致生物有效性的變化[23]，這些因素可能導致不同的微生物響應特征。本研究對某冶煉廠周邊農田土壤中細菌群落的分析表明，相對于pH等土壤因子，PAHs污染未能明顯影響細菌多樣性和群落組成(表2，圖4)，這可能與研究區域土壤污染水平相對不高和PAHs老化后生物有效性低有關。

由于部分細菌具有PAHs降解功能，本研究重點分析了土壤中潛在PAHs降解菌的變化情況。從高通量測序數據中可以發現分支桿菌、紅球菌、Actinomadura、Nocardioides等革蘭氏陽性PAHs降解細菌的相對豐度與Σ15PAHs顯著正相關。另一方面，PAH-RHD是細菌降解PAHs的關鍵酶，其基因(PAH-RHDα)拷貝數通常反映了PAHs降解細菌的豐度[13]，而高濃度多環芳烴往往導致土壤中PAH-RHDα基因的富集[24]。本研究未能檢出革蘭氏陰性菌PAH-RHDα基因，提示土壤中該類降解菌的數量較少。對PAHs含量較高土壤中革蘭氏陽性菌PAH-RHDα的克隆測序結果表明其組成單一，主要屬于nidA3/fadA1類群[25]，與分支桿菌等細菌所含序列較為接近。因此，以分支桿菌為代表的革蘭氏陽性菌可能是該區域農田土壤的主要PAHs降解微生物。

微生物降解是土壤PAHs消減的主要機制，以分支桿菌為代表的PAHs降解細菌[26-27]已被用于污染土壤的生物強化修復。但是，微生物的降解能力受到包括土壤特性在內的多種因素制約[28]，不適宜的環境條件可能影響微生物強化等修復策略的效果。本研究的意義在于考察PAHs污染對農田細菌群落的影響，主要揭示了自然污染狀態下PAHs降解細菌的富集，這些微生物可能較為適應該冶煉企業周邊污染農田的條件，在污染物降解中具有潛在作用。這些結果將為實施污染土壤生物修復提供重要的科學依據。

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Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) Pollution and Their Effects on Bacterial Community in Agricultural Soils Near a Smelting Plant

Wu Yucheng1,2, Lin Xiangui1,2,*, Zhu Qinghe1,2, Zeng Jun1,2, Ding Qingmin1,2

1. State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China 2. Joint Open Laboratory of Soil and the Environment, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences and Hong Kong Baptist University, Nanjing 210008, China

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are a group of persistent organic pollutants that may pose significant risks on soil biota. In this study, 17 soil samples were collected from agricultural sites potentially polluted by a smelting plant in the outskirt of Nanjing, Jiangsu Province. The distances of the sampling sites to the potential PAHs source ranged from 500 m to 5 km. The total amounts of 15 PAHs (Σ15PAHs) in these samples ranged from 0.25～31.08 mg·kg-1, with most contaminated samples (> 1 mg·kg-1) found in closely adjacent sites to the plant. High molecular weight PAHs (≥ 4 rings) were dominant in most samples. PAH diagnostic ratios suggested these PAHs were largely related to coal and fossil fuel combustion. To reveal the bacterial community composition, 16S rRNA gene was amplified and analyzed using next generation sequencing. The Illumina’s MiSeq sequencing produced more than 225 000 reads, with averagely 13 257 reads obtained for each sample. The most abundant phyla across all samples were Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria and Acidobacteria. Bacterial alpha diversity, as measured by observed species, Chao1, Phylogenetic Diversity (PD), Shannon and Simpson indices, were directly correlated to pH rather than PAHs. An ordination analysis indicated that the bacterial community composition was significantly influenced by pH and total phosphorus, while the contribution of PAHs was minimal. However, the PAHs levels were positively correlated to the relative abundance of a few potential PAHs degraders such as Mycobacterium, Rhodococcus, Actinomadura and Nocardioides. This trend was further confirmed by the quantitative PCR (qPCR) quantification of bacterial PAH ring-hydroxylating dioxygenase genes (PAH-RHDα). Although the gram negative (GN) bacterial PAH-RHDα gene abundance was below the detectable level, gram positive (GP) PAH-RHDα was recovered from all samples and its abundance was positively correlated with the PAHs pollution. The GP PAH-RHDα gene in three selected samples affiliated to the nidA3/fadA1 group, and their closest matches in Genbank were largely derived from Mycobacterium. Overall, these findings indicate the influence of industrial PAHs emission on the adjacent agricultural soils. The PAHs pollution may cause the enrichment of specific PAHs degraders such as Mycobacterium, although soil pH could be more significant in shaping total community of soil bacteria.

polycyclic aromatic hydrocarbons; soil bacteria; PAH-ring hydroxylating dioxygenase; Mycobacterium; community effect

10.7524/AJE.1673-5897.20151026001

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)(2014CB441106)；國家自然科學基金(41371310，41201301)；江蘇省自然科學基金(BK20131462)；土壤與農業可持續發展國家重點實驗室優秀青年人才項目(Y212000014)

吳宇澄(1977-)，男，副研究員，研究方向為污染土壤生物修復及污染生態學，E-mail: ycwu@issas.ac.cn

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: xglin@issas.ac.cn

2015-10-26 錄用日期：2015-11-16

1673-5897(2016)2-484-08

Q142；X53

A

簡介：林先貴(1955-)，男，研究員，博士生導師。主要研究方向土壤微生物多樣性及其生態功能、環境微生物及其應用，發表學術論文300余篇。

吳宇澄, 林先貴, 朱清禾, 等. 冶煉企業周邊農田土壤的多環芳烴污染及其細菌群落效應[J]. 生態毒理學報，2016, 11(2): 484-491

Wu Y C, Lin X G, Zhu Q H, et al. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) pollution and their effects on bacterial community in agricultural soils near a smelting plant [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 484-491 (in Chinese)