人工甜味劑在不同類型土壤中的淋溶行為研究

馬鈴，馮碧婷，周萌，胡宏偉，孫紅文,*

1. 南開大學環境科學與工程學院 環境污染過程與基準教育部重點實驗室，天津 300350 2. 天津市機動車排污檢控中心，天津 300391 3. 天津泰達綠化集團有限公司，天津 300457

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人工甜味劑在不同類型土壤中的淋溶行為研究

馬鈴1，馮碧婷1，周萌2，胡宏偉3，孫紅文1,*

1. 南開大學環境科學與工程學院 環境污染過程與基準教育部重點實驗室，天津 300350 2. 天津市機動車排污檢控中心，天津 300391 3. 天津泰達綠化集團有限公司，天津 300457

人工甜味劑(artificial sweeteners)是一類人工合成或半合成的蔗糖替代品，廣泛應用于食品、藥物、個人護理品和飼料中，但是大多數人工甜味劑在人和動物體內幾乎不被代謝而隨尿液和糞便直接進入環境。在天津污水河沿線及甜味劑廠附近不同深度土層中檢測到安賽蜜、糖精、甜蜜素和三氯蔗糖。為探討人工甜味劑在土壤中的移動性及其對地下水污染的風險，應用土柱淋溶實驗研究了安賽蜜和三氯蔗糖在2種土壤中的淋溶行為，并觀測了人工甜味劑淋溶對土柱淋出液的溶解性有機質(DOM)、pH以及電導率 (EC) 的影響。結果表明安賽蜜和三氯蔗糖在2種土壤中表現出較強的移動性，超過87%的甜味劑均被淋出，只有不到13%的甜味劑被土壤截留或損失，因此對地下水具有較大的風險。安賽蜜和三氯蔗糖能夠促進土壤溶解性有機質的溶出，但對淋出液的pH和電導率無顯著影響。

人工甜味劑；土壤；淋溶行為

Received 29 November 2015 accepted 26 February 2016

人工甜味劑是一類具有甜味而幾乎不被人體代謝的人工合成或半合成的蔗糖替代品，由于其低成本、高甜度、極易溶于水等特性而被廣泛應用[1-3]。但是，人工甜味劑對人體的安全性一直備受爭議，各國都給出了較嚴格的規定[4]。大多數人工甜味劑在人和動物體內幾乎不被代謝而隨尿液和糞便直接進入環境介質[5]，而且研究已表明一些人工甜味劑在環境中具有持久性，在環境中的濃度表現出逐漸增高的趨勢[2,6]。近年來，幾種典型的人工甜味劑(糖精、安賽蜜、甜蜜素和三氯蔗糖)在水體中已廣泛被檢出且濃度較高[7-11]，本課題組也在天津的污水處理廠、地表水、飲用水、降水及地下水中檢測到上述4種人工甜味劑[12]。雖然4種典型的人工甜味劑極性強、水溶性高，容易分配到水相中，但仍有研究報道人工甜味劑能夠通過污水灌溉、糞肥返田、污泥施肥以及生活垃圾填埋等農業活動進入土壤[13-15]。

目前，有關土壤中人工甜味劑的環境調查研究鮮有報道，僅有少量文獻研究了人工甜味劑在土壤中的遷移和降解。研究表明甜蜜素和糖精在土壤中降解較快，半衰期分別為0.8和3.3 d，安賽蜜和三氯蔗糖降解較為緩慢，表現出較強的穩定性[13]。人工甜味劑由于較強的極性而難以吸附在土壤顆粒中，因此，相對穩定的人工甜味劑很可能在土壤中發生淋溶或是在含水層中穩定存在，從而對地下水帶來潛在風險。

本研究初步調查了天津市污水河沿線及工業點源附近土壤中不同深度層中甜味劑的污染狀況，選取了2種典型的人工甜味劑安賽蜜和三氯蔗糖為實驗對象，對其在2種不同類型土壤中的淋濾行為進行了研究，并分析了土壤理化性質對甜味劑淋溶行為的影響。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與設備

Agilent 1200系列液相串聯6410B三重四級桿質譜(美國Agilent Technologies公司)；固相萃取裝置(美國Supelco公司)；SMADZU TOC-Vcph型TOC分析儀(日本島津公司)。

1.2 試劑與材料

安賽蜜、糖精、甜蜜素和三氯蔗糖標準品購自美國Sigma-Aldrich公司；3種氘代內標(安賽蜜-d4、糖精-d4和三氯蔗糖-d6)購自加拿大Toronto Research Chemicals公司；離子對試劑Tris (三羥甲基氨基甲烷)購自美國Sigma-Aldrich公司；醋酸銨、醋酸鈉、甲醇、乙腈、丙酮均為色譜純，購自德國CNW Technologies公司，其他試劑氯化鈣、石英砂等均為分析純；Poly-Sery PWAX固相萃取柱(3 mL/60 mg)和50 mL聚丙烯離心管均購自德國CNW Technologies公司；實驗全過程采用去離子水。

淋溶裝置的主體采用玻璃材質的圓柱型柱子，內徑5 cm，高60 cm。

2種供試土壤分別采集于天津市南開區花園和天津市東麗區農田，分別屬于粘土和壤粘土，具體理化性質見表1。經風干后的土壤充分混勻，采用四分法，經研磨后過2 mm孔徑篩，分別裝入外層包有鋁箔紙的密封袋中，于-20 ℃保存。

表1 土壤基本理化性質

注：DOC，溶解性有機碳；AEC，陰離子交換容量；CEC，陽離子交換容量。

Note: DOC is an acronym that stands for dissolved organic carbon; ACE is anion exchange capacity; CEC is cation exchange capacity.

1.3 環境調查

在天津污水河沿線及一個人工甜味劑工廠附近共4個采樣點采集土壤表層(0～10 cm)及亞表層(10～30 cm)土壤，每個樣品均在100 m2地塊，按照梅花采樣法采集土壤，現場混合，帶回實驗室。

1.4 實驗方法

1.4.1 土柱淋溶實驗

通過淋溶試驗評價污染物在土壤中的移動性和污染地下水的可能性，具體的試驗操作參考經濟合作與發展組織(OECD)準則中的土柱淋溶實驗方法[16]。將土壤在121 ℃下高壓蒸汽滅菌30 min后裝柱。土柱的高度為30 cm，下填2 cm玻璃纖維及2 cm石英砂，上面覆蓋2 cm石英砂，然后在土柱表層分別加入1 mL 10 mg·L-1三氯蔗糖或安賽蜜的標準使用液，并用鋁箔紙包裹避光，靜置24 h后開始淋溶實驗。

用0.01 mol·L-1氯化鈣溶液模擬雨水對土柱進行淋溶，直到淋出液沒有目標物檢出，同時測定土柱的最大持水量。經測定，土1和土2的最大飽和持水量分別為：275 mL 和300 mL。每淋出25 mL濾液(1個孔體積)為1個采樣點，每天可收集3批樣品，每個柱子收集40個樣品，共1 000 mL淋溶液。本實驗淋溶液用量基于天津市近10年年平均降水量(500 mm)計算得出。淋溶速度并不均勻，平均淋溶速度為 0.05 mL·min-1。

1.4.2 吸附平衡常數(Kd)值的測定

準確稱取1.5 g土壤樣品于50 mL聚丙烯離心管中，加入15 mL 0.01 mol·L-1氯化鈣溶液(溶液中分別含有100 μg·L-1安賽蜜/三氯蔗糖標準液)，于(25±0.5) ℃下進行恒溫振蕩24 h (經吸附動力學預實驗測得，2種人工甜味劑在6 h后均已達到吸附平衡)。在4 200 r·min-1轉速下離心10 min，取1 mL上清液再于15 000 r·min-1轉速下離心10 min。取200 μL上清液，并加入200 μL對應的氘帶內標，用Vortex混合均勻后，測定人工甜味劑含量。吸附量由差值法獲得，Kd值由土壤吸附態濃度Qe(μg·kg-1)與溶液平衡態濃度Ce(μg·L-1)的比值計算。

1.5 測定方法與實驗數據分析

1.5.1 樣品中人工甜味劑的分析測定

水樣：取1 mL淋出液，于15 000 r·min-1轉速下離心10 min。取100 μL上清液于進樣瓶中，同時加入100 μL對應的氘帶內標溶液(80 μg·L-1三氯蔗糖-d6、40 μg·L-1糖精-d4和40 μg·L-1安賽蜜-d4)，充分混合，供HPLC-MS/MS測定。

土壤樣品：土壤樣品經冷凍干燥后，研磨，過0.2 mm孔徑篩。準確稱取5 g土壤樣品，加入10 μL對應的氘帶內標溶液(2 mg·L-1三氯蔗糖-d6，1 mg·L-1糖精-d4和1 mg·L-1安賽蜜-d5)。用25 mL 0.01 mol·L-1醋酸鈉溶液(pH=4)進行提取，提取2次，每次振蕩20 min，合并2次上清液過固相萃取小柱。將洗脫液氮吹至近干，用甲醇定容到0.5 mL，取200 μL濃縮液供HPLC-MS/MS分析測定。固相萃取方法以及液相色譜和質譜條件參考本課題組已建立的方法[17-18]，加標回收率及方法檢出限和定量限見表2。

表2 土壤中4種人工甜味劑(AS)的加標回收率及方法檢出限和定量限

1.5.2 水樣中pH、DOC和電導率的測定

水樣中pH和電導率的測定方法參照《土壤分析手冊》[19]；土壤溶解性有機碳(DOC)的提取：用土水比為1:2的純凈水振蕩提取16 h，離心，將上清液過0.45 μm的微孔濾膜，采用SMADZU TOC-Vcph型TOC分析進行測定[20]。

1.5.3 數據分析和質量控制

每1處理土柱作2個平行，同時設置空白對照組。淋出液和土壤中人工甜味劑的含量取2個平行樣品的算術平均值。數據分析采用Excel處理軟件。使用SPSS對數據進行統計學分析，采用Spearman法進行相關性分析。

2 結果(Results)

2.1 人工甜味劑在天津若干土壤中的污染狀況

沿天津大沽排污河沿線三3個點(D1～3)及1個甜味劑工廠附近的點位(T)采樣，分別采集表層土和亞表層土(圖1)。在4個采樣點均檢測出安賽蜜、糖精和甜蜜素，濃度在0.22～15.57 μg·kg-1之間；而在D1和D2處檢出三氯蔗糖，濃度在0.55 ～ 1.38 μg·kg-1之間。糖廠附近糖精和甜蜜素濃度明顯高于其他點位，屬于點源污染。在同一個點位的亞表層土中人工甜味劑的濃度明顯低于表層土。

圖1 人工甜味劑在天津大沽排污河沿線(D1-3)及某糖廠(T)附近表層土(A)和亞表層土(B)中的濃度Fig. 1 Concentrations of artificial sweeteners in the topsoil (A) and subsoil (B) at sites along Dagu Drainage Canal (D1-3) and a sugar factory (T) in Tianjin

圖2 安賽蜜在2種土壤中的(a)相對淋溶曲線及(b)累積淋溶曲線Fig. 2 (a) Relative leaching curves and (b) cumulative leaching curves of acesulfame in the two soils

圖3 三氯蔗糖在兩種土壤中的(a)相對淋溶曲線及(b)累積淋溶曲線Fig. 3 (a) Relative leaching curves and (b) cumulative leaching curves of sucralose in the two soils

2.2 模擬降雨條件下2種土壤中安賽蜜的淋溶行為

由圖2(a)可知，土1中，安賽蜜從第4個孔體積(淋濾第2天)開始淋出，第8 ～ 9個孔體積時(第3天)淋出濃度達到最大值(94.8 μg·L-1)，到第21個孔體積時(第7天)已有90%的安賽蜜被淋出(圖2(b))，并且安賽蜜從開始淋出到淋出液濃度降至1 μg·L-1以下，共經過17個孔體積的時間。土2中，安賽蜜從第9個孔體積(第3天)開始淋出，到第13 ～ 14個孔體積(第5天)淋出濃度達到最大值(66.1 μg·L-1)，在第33個孔體積時(第11天)淋出液濃度降至1 μg·L-1以下，共經過24個孔體積的時間。由圖2(b)可知，安賽蜜在土1中的淋出總量較大，共有9.24 μg (92.4%)被淋出，說明其在土壤中的移動性更強。

表3 實驗結束時2種人工甜味劑在不同深度土壤及淋出液中的分布

此外，對淋溶體系中安賽蜜進行了質量平衡計算(表3)，對于土1，高達92.44%的安賽蜜被淋出，只有3.73%的安賽蜜被土壤截留，大約有3.83%的安賽蜜損失；而土壤中殘留的安賽蜜主要存在于土壤下層(25～30 cm段)。土2中，淋出液和土柱中的安賽蜜總回收率高達99.21%，損失的安賽蜜僅占加入量的0.79%。

2.3 模擬降雨條件下2種土壤中三氯蔗糖的淋溶行為

由圖3(a)可知，土1中，三氯蔗糖從第7個孔體積(淋濾第3天)開始淋出，在第11 ～12個孔體積(第4天)時淋出濃度達到最大值(62.7 μg·L-1)，之后到第30個孔體積(第10天)時淋出液濃度降至1 μg·L-1以下。類似地，對于土柱2，三氯蔗糖也從第7個孔體積(淋濾第3天)開始淋出，到第13 ～ 14個孔體積(第5天)時淋出濃度達到最大值(60.4 μg·L-1)，并在第28個孔體積(第10天)時淋出液濃度降至1 μg·L-1以下。由圖3(b)可知，三氯蔗糖在2種土壤中的總淋出量和淋溶速率相近，土2略慢于土1。

同樣對淋溶體系中三氯蔗糖進行了質量平衡計算(表3)，土1中93.33%的三氯蔗糖被淋出，僅6.67%的三氯蔗糖被土壤截留或損失；土2中，92.31%的三氯蔗糖被淋出，大約5.13%的三氯蔗糖被土壤截留，最終損失2.56%的三氯蔗糖。土壤中殘留的三氯蔗糖同樣存在于土壤下層(25～30 cm段)。

2.4 人工甜味劑的Kd值及其對土柱淋出液理化性質的影響

為解釋人工甜味劑在土壤中的移動性，實驗中采用單點法測定了安賽蜜和三氯蔗糖在2種土壤中的吸附常數(Kd)值。結果顯示，安賽蜜在土1和土2中的Kd值分別為4.24和13.7 L·kg-1，三氯蔗糖在2種土壤中的Kd值分別為1.38和2.28 L·kg-1。

同時測定了淋出液的DOC、pH及EC值，以考察甜味劑淋出對土壤溶液理化性質的影響。對于未添加安賽蜜的土柱(圖4a)，淋出液中DOC隨孔體積的增加呈現降低的趨勢；而在添加了安賽蜜的土柱淋出液中，DOC呈現出先增大后降低的趨勢，最終降到與未添加安賽蜜的土柱相似的濃度水平。經統計學分析，添加了安賽蜜的土柱淋出液的DOC隨孔體積的變化與安賽蜜隨孔體積的變化之間存在顯著相關性(P<0.05)，因此可以推測，土壤中的安賽蜜的淋溶帶動了溶解性有機質的溶出。為了驗證實驗結果，本研究還進行了搖瓶實驗，實驗結果發現，對于空白對照體系，其上清液中DOC的平均濃度為10.0 mg·L-1；對于添加了安賽蜜的體系，其上清液中DOC的平均濃度為42.2 mg·L-1，約為空白組上清液中DOC濃度的4倍。該實驗結果再次驗證了安賽蜜能夠促進土壤溶解性有機質的溶出。

圖4 在添加和未添加(a)安賽蜜或(b)三氯蔗糖的條件下，土柱淋出液中DOC的濃度變化Fig. 4 Concentrations of DOC in leachates from soil columns with and without (a) acesulfame and (b) sucralose

對三氯蔗糖而言，添加組與空白組中淋出液DOC隨孔體積的變化趨勢(圖4b)與安賽蜜相似，且在統計學上，添加三氯蔗糖的土柱淋出液DOC隨孔體積的變化曲線與三氯蔗糖的淋溶穿透曲線之間存在顯著相關性(P<0.05)，因此土壤中三氯蔗糖的淋溶帶動了溶解性有機質的溶出。同樣地，搖瓶實驗也驗證了這一點，對于添加了三氯蔗糖的體系，其上清液中DOC的平均濃度為38.5 mg·L-1，約為空白組上清液中DOC濃度的3.8倍。

本研究還測定了添加及未添加甜味劑，淋出液中pH及電導率(EC)的變化，由于土壤強的緩沖能力，添加甜味劑的實驗組與對照組淋出液的pH及EC值沒有明顯差異(數據未顯示)。

3 分析討論(Analysis and discussion)

土壤調查中主要檢測出安賽蜜、糖精和甜蜜素，三氯蔗糖在部分樣品中也有檢出。人工甜味劑在土壤中的污染水平在文獻中很少報道。本文的研究結果表明，污水灌溉及工業點源污染可造成土壤中人工甜味劑的污染。Buerge等[13]研究發現，甜蜜素和糖精在土壤中的降解半衰期較短，分別為0.4～6 d和3～12 d，這可以用來解釋結論中亞表層土中甜蜜素和糖精的濃度顯著低于表層土。此外，化學物質在不同深度土層中的分布還與其吸附截留和淋溶有關。由于這4種人工甜味劑極性較強(logKow在-1.61～-0.91之間)，水溶性較高(Sw在4～283 g·L-1之間)，所以穩定性較強的人工甜味劑很有可能向下遷移至地下水。

通過土柱淋溶實驗發現安賽蜜和三氯蔗糖均表現出較強的淋溶特性，對地下水具有較大的風險。對于安賽蜜(pKa=2.0，logKow= -1.33，溶解度為270 g·L-1)，其分子中含有多個極性基團，而且在實驗條件下主要以陰離子形式存在，土壤膠體顆粒帶負電，對其具有靜電斥力作用，促使其進入孔隙水進行遷移。而土壤中目標化合物的淋溶性取決于該物質在土壤顆粒上的吸附性和在土壤中的溶解性之間的平衡[21]。由此可知上述吸附作用對目標化合物移動性的影響不占主導地位，而陰離子的存在形式可能增加了化合物的溶解性，使其更易分配到水相中。對于三氯蔗糖(pKa=11.8，logKow= -1.0，溶解度為283 g·L-1)，它為中性分子，但是存在多個羥基，水溶性較高，所以三氯蔗糖在土1和土2中的淋出量分別達到了93%和92%。另外，用吸附常數值可進一步解釋人工甜味劑在土壤中的移動性，相比于其他傳統憎水性化合物高達103～105的吸附系數，人工甜味劑的吸附系數很低，在1.38～13.7 L·kg-1之間，具有較強的流動性。而對于土2種安賽蜜的淋出速度和總量都明顯低于土1，這主要是因為土2具有較高的有機質含量，較低的DOC含量，因此對于有機污染物具有較大的截留能力[22]。

安賽蜜和三氯蔗糖的淋溶曲線存在一定差異。對于同一種土壤，三氯蔗糖的淋溶曲線不同于安賽蜜。就土1而言，三氯蔗糖淋出時間略晚于安賽蜜，且淋出濃度的最大值低于安賽蜜，但是兩者的總淋出量相近，分別為9.3 μg和9.2 μg。而在土壤中檢測出三氯蔗糖的含量略高于安賽蜜，這不能完全用Kd值解釋，主要可歸結為2種化合物與溶解性有機質的交互作用不同。對于土2，三氯蔗糖與安賽蜜的淋出時間和濃度峰值均較為接近，但三氯蔗糖的總淋出量高于安賽蜜。原因是土2種人工甜味劑的Kd值相差一個數量級，因此，2種物質在水土之間的分布差異較為明顯，土2截留了5%的三氯蔗糖、12%的安賽蜜。

實驗中，安賽蜜和三氯蔗糖的降解損失較少(<4%)，印證了文獻中安賽蜜和三氯蔗糖在土壤中比較穩定的結論[13]。因此這2種人工甜味劑一旦污染地表土，污染地下水的可能性較大。相比于地表水，目前世界范圍內對于地下水的監測尚十分有限。部分研究者在垃圾填埋場、養豬場化肥池(人工甜味劑是豬飼料的添加劑)以及污水管網下游地下水中主要檢測出安賽蜜，其最高濃度達到了18 μg L-1，而其它人工甜味劑極易被微生物降解，濃度較低[9-11,23]。另外，本課題組在天津5處地下水中也廣泛檢測出4種典型的人工甜味劑[12]。針對于土壤及地下水大范圍的調查，特別是污染源沿線的調查還有待進一步展開。

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Study on the Leaching Behavior of Typical Artificial Sweeteners in Soils

Ma Ling1, Feng Biting1, Zhou Meng2, Hu Hongwei3, Sun Hongwen1,*

1. College of Environmental Science and Engineering, Ministry of Education Key Laboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria, Nankai University, Tianjin 300350, China 2. Tianjin Vehicle Emission Inspection and Control Center, Tianjin 300391, China 3. Tianjin TEDA Green Group Company, Tianjin 300457, China

Artificial sweeteners (ASs) are used worldwide as sugar substitutes in remarkable amounts in food, pharmaceuticals, personal care products as well as in animal feed, however, the majority of artificial sweeteners ingested by human and animals are almost not absorbed or metabolized and get into environment through the urine and feces directly. In this study, acesulfame, saccharin, cyclamate, and sucralose were detected in different soil layers along a sweage canal and around a sweetener factory in Tianjin. Soil column leaching experiments on acesulfame and sucralose were conducted to study their mobility and the possible risk to contaminate ground water. The results showed that more than 87% of the two tested sweeteners were detected in leachates and less than 13% of them existed in soil column or lost, mainly in the deep layer, indicating the strong mobility. Therefore, it may cause risk to groundwater. Furthermore, the influence of acesulfame and sucralose on dissolved organic matter (DOM), pH and electrical conductivity (EC) of the leachates were measured. The results indicated that both of the two artificial sweeteners could enhance the leaching of DOM, while they rarely had any impact on pH or EC of the leachates.

artificial sweeteners; soil; leaching behavior

10.7524/AJE.1673-5897.20151129005

國家自然科學基金(41225014)；科技部“973”項目(2014CB441104)

馬鈴(1991-)，女，碩士，研究方向為環境化學，E-mail: maling@mail.nankai.edu.cn

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: sunhongwen@nankai.edu.cn

2015-11-29 錄用日期：2016-02-26

1673-5897(2016)2-650-08

X171.5

A

簡介：孫紅文(1967—)，女，環境化學博士，教授，主要研究方向為環境污染化學、人體健康與生態修復，發表論文260余篇。

馬鈴, 馮碧婷, 周萌, 等. 人工甜味劑在不同類型土壤中的淋溶行為研究[J]. 生態毒理學報，2016, 11(2): 650-657

Ma L, Feng B T, Zhou M, et al. Study on the leaching behavior of typical artificial sweeteners in soils [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 650-657 (in Chinese)