4種二烷基次膦酸鹽阻燃劑對斑馬魚胚胎的毒性研究

陳敏杰，黎麗莎，陳馮杰，劉鈺晨,*，張捷，梁勇,3,，劉繼延

1. 江漢大學 醫學院，武漢 430056 2. 華中農業大學 資源與環境學院，武漢 430070 3. 江漢大學 環境與健康研究院，武漢 430056 4. 江漢大學 光電化學材料與器件教育部重點實驗室 化學與環境工程學院，武漢 430056

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4種二烷基次膦酸鹽阻燃劑對斑馬魚胚胎的毒性研究

陳敏杰1，黎麗莎2，陳馮杰2，劉鈺晨1,*，張捷2，梁勇1,3,4，劉繼延4

1. 江漢大學 醫學院，武漢 430056 2. 華中農業大學 資源與環境學院，武漢 430070 3. 江漢大學 環境與健康研究院，武漢 430056 4. 江漢大學 光電化學材料與器件教育部重點實驗室 化學與環境工程學院，武漢 430056

二烷基次膦酸鹽(DPs)作為一種新型有機磷阻燃劑正在被大量合成并應用，但關于其毒理學效應的研究還十分匱乏。研究者首次以斑馬魚胚胎作為實驗模型，初步探討了2種新型DPs阻燃劑甲基環己基次膦酸鋁(AMHP)、甲基環己基次膦酸鈣(CMHP)和2種已市場化生產的DPs阻燃劑甲基乙基次膦酸鋁(AMEP)、二乙基次膦酸鋁(ADEP)對魚類的急性毒性效應。結果表明，AMHP和CMHP對斑馬魚胚胎無明顯毒性效應；500 mg·L-1的AMEP和ADEP能顯著增加斑馬魚胚胎死亡率，降低其出膜率。AMHP和CMHP的水解產物甲基環己基次膦酸在濃度為1 000 mg·L-1時，可使斑馬魚胚胎出膜率下降，并導致胚胎死亡，推測DPs的水解產物二烷基次膦酸是造成斑馬魚胚胎死亡的主要因素。進一步比較去除卵膜后，DPs對斑馬魚胚胎的毒性效應，發現DPs主要通過影響斑馬魚胚胎的出膜進而造成胚胎的死亡。上述研究結果從水生生物毒性的角度為DPs阻燃劑是否能作為溴化阻燃劑和傳統有機磷阻燃劑的替代品提供了實驗依據。

二烷基次膦酸鹽；二烷基次膦酸；斑馬魚胚胎；毒性

阻燃劑是用于改善材料易燃性的化學品。研究發現，多種大規模使用的溴化阻燃劑能夠在水環境和食物鏈中累積，具有內分泌干擾效應[1-2]，對環境和人類健康造成了威脅，現已被包括美國和歐盟等越來越多的國家禁用[3]。以二烷基次膦酸鹽(DPs)類為代表的新型有機磷阻燃劑作為溴化阻燃劑的優秀替代品，被廣泛運用在化工、電子、紡織和建材等行業中[4]。其中，德國克萊恩公司開發的甲基乙基次膦酸鋁(AMEP)、二乙基次膦酸鋁(ADEP)阻燃劑在全球范圍內已應用多年。甲基環己基次膦酸鋁(AMHP)是我國自主研發，擁有知識產權的一種新型二烷基次膦酸鹽阻燃劑，目前已經開始大規模生產和應用[5]。

雖然DPs已生產應用多年，但其環境毒性卻沒有受到相應的關注。2014年，牛宇敏等[6]在湖北一家DPs生產工廠附近的環境中檢測到了多種二烷基次膦酸鋁(ADPs)和其水解產物二烷基次膦酸(DPAs)的存在。在表層土壤中，ADPs和DPAs的含量分別為3.9 ～ 1 279.3 μg·kg-1和1.0 ～ 448 μg·kg-1。在廢液廢渣傾倒處和排污口的所有土壤和沉積物泥芯樣品中均檢測到ADPs，濃度范圍為30.8 ～ 4 628.0 μg·kg-1；與此同時，DPAs的檢出率> 90%，濃度范圍為1.1 ～ 374.6 μg·kg-1。有研究發現，ADEP對大型蚤(Daphnia magna)具有中等程度的慢性毒性，21 d的半數致死量為3.2 mg·L-1[5]。此外，澳大利亞國家工業化學品通告評估署也曾報道，ADEP對大鼠、兔、荷蘭豬具有極低的急性毒性。但是目前對其他DPs的毒理學研究還十分匱乏。

模式生物斑馬魚具有產卵周期短，產卵量大，胚胎體積小且透明，發育迅速等優勢，可以觀察多種毒性指標，因此被廣泛運用于毒理學研究[7-9]。本研究以斑馬魚胚胎作為實驗模型，首次比較研究了AMHP、甲基環己基次膦酸鈣(CMHP)、AMEP和ADEP 4種典型的DPs，及AMHP和CMHP的水解產物甲基環己基次膦酸(MHPA)急性暴露后，對斑馬魚胚胎出膜率、死亡率和生長發育的影響及作用機制，初步評估了DPs作為環境友好型阻燃劑對高等水生生物的毒性效應。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

AMHP、CMHP和MHPA由江漢大學光電化學材料與器件教育部重點實驗室合成，AMEP和ADEP購自德國克萊恩公司。這5種化合物的純度均大于95%，其結構式如圖1所示。

將AMHP、AMEP和ADEP溶于曝氣水配成500 mg·L-1的儲備液，CMHP和MHPA溶于曝氣水中配成1 000 mg·L-1的儲備液，持續攪拌24 h，開展暴露實驗時直接用曝氣水稀釋成需要的工作濃度。

實驗所用的AB系斑馬魚(Danio rerio)由中國科學院水生生物研究所贈予，飼養于流水養殖系統(上海海圣工貿有限公司)，按照《斑馬魚手冊》提供的方法進行日常管理。

1.2 實驗方法

暴露前1 天將成魚按雌雄比例1:2配對，第2天早上收集自然產卵的胚胎并清洗干凈。挑選出發育良好的胚胎，從受精后4 h (4 hour post-fertilization，4 hpf)開始暴露。AMHP、AMEP和ADEP的暴露濃度為0、50、100、200和500 mg·L-1，CMHP和MHPA的暴露濃度為0、50、100、200、500、1 000 mg·L-1，對照組為曝氣水組。暴露實驗在十二孔細胞培養板中進行。每個濃度共60粒胚胎，隨機平均分配到3個平行孔中。暴露開始后，以24 hpf作為觀察起點，每24 小時顯微觀察胚胎的發育情況，記錄胚胎死亡數和出膜數、對發育畸形的個體拍照，并每隔24 小時更換新鮮的暴露溶液。根據實驗需要，在暴露開始前、即4 hpf前，使用1%鏈蛋白酶人工去除斑馬魚胚胎的卵膜。

圖1 化合物結構式Fig. 1 Structure of chemicals

圖2 4種DPs暴露對斑馬魚胚胎死亡率的影響Fig. 2 The mortality of zebrafish embryo after 4 kinds of dialkyl phosphinate exposure

1.3 數據統計與分析

所有數據用“平均值±標準誤差”表示。運用Graphpad Prism 5.0軟件進行實驗數據的統計。采用單因素方差分析(One way-ANOVA)計算顯著差異。P<0.05表示與對照組比較存在顯著差異；P<0.01表示與對照組比較存在極顯著差異。利用logistic方程模型計算半數致死濃度[10]。

2 結果(Results)

2.1 DPs暴露對斑馬魚胚胎死亡率的影響

結果顯示，對照組斑馬魚胚胎死亡率不超過5%。AMHP和CMHP各濃度暴露組和對照組比較，斑馬魚胚胎并沒有發生明顯死亡現象(圖2a、2b)。最高濃度1 000 mg·L-1CMHP暴露引起斑馬魚胚胎死亡率略為升高，但無顯著性差異。AMEP和ADEP暴露造成了斑馬魚胚胎的死亡(圖2c、2d)；在最高濃度500 mg·L-1暴露實驗中，與對照組比較，這2種化合物暴露的胚胎均從24 hpf開始死亡率顯著升高；在200 mg·L-1暴露實驗中，與對照組比較，AMEP和ADEP暴露的胚胎從144 hpf開始死亡率顯著升高，168 hpf時AMEP和ADEP的半數致死濃度分別為288.79 mg·L-1和396.16 mg·L-1；其他各暴露組胚胎死亡率與對照組相比沒有顯著性差異。

2.2 DPs暴露對斑馬魚胚胎出膜率的影響

如圖3所示，對照組斑馬魚胚胎從48 hpf開始出膜，到96 hpf時出膜率達100%。AMHP和CMHP暴露對胚胎出膜率沒有顯著影響(圖3a、3b)；最高濃度1 000 mg·L-1CMHP暴露引起斑馬魚胚胎出膜率略為降低，但無顯著性差異。50、100和200 mg·L-1AMEP和ADEP暴露對胚胎出膜率無明顯影響，而500 mg·L-1AMEP和ADEP暴露后出膜率為0，與對照組比較有極顯著差異(圖3c、3d)。

2.3 MHPA暴露對斑馬魚胚胎死亡率和出膜率的影響

MHPA是AMHP和CMHP的主要水解產物。與對照組比較，1 000 mg·L-1MHPA暴露組胚胎的死亡率從24 h開始極顯著升高，在120 hpf時死亡率達到100%(圖4a)，168 hpf時MHPA的半數致死濃度為668.77 mg·L-1。1 000 mg·L-1MHPA暴露組胚胎的出膜率顯著低于對照組(圖4b)。其他各暴露組胚胎的死亡率與對照組比較均無顯著差異，但出膜時間晚于對照組。

圖3 4種DPs暴露對斑馬魚胚胎出膜率的影響Fig. 3 The hatching rate of zebrafish embryo after 4 kinds of dialkyl phosphinate exposure

圖4 不同濃度MHPA暴露對斑馬魚胚胎死亡率和出膜率的影響Fig. 4 The mortality and hatching rate of zebrafish embryo after MHPA exposure

圖5 AMEP和ADEP暴露對無卵膜胚胎死亡率的影響Fig. 5 Mortality of zebrafish embryo with removed chorion after AMEP and ADEP exposure

2.4 AMEP和ADEP暴露對無卵膜胚胎死亡率的影響

考慮到AMEP和ADEP可降低斑馬魚胚胎的出膜率并造成斑馬魚胚胎的死亡，500 mg·L-1AMEP和ADEP暴露后出膜率為0，其半數致死濃度分別為288.79 mg·L-1和396.16 mg·L-1。我們進一步利用酶解去除了卵膜的斑馬魚胚胎進行了相似的暴露實驗。結果如圖5所示，各濃度AMEP和ADEP暴露168 h后，無卵膜胚胎的死亡率相對未除卵膜時明顯降低，其中200 mg·L-1AMEP和ADEP暴露組胚胎死亡率與對照組相比均無顯著差異。而500 mg·L-1AMEP暴露后其死亡率由93%降低至37%，500 mg·L-1ADEP暴露后其死亡率由67%降低至28%。

3 討論(Discussion)

作為新合成的有機磷阻燃劑，有機次磷酸鹽的毒性大小及其潛在的環境影響鮮有文獻報道。僅有2013年的一項研究表明，ADEP對大型蚤的生長和繁殖具有明顯的毒性效應，其48 h半致死濃度為18 mg·L-1，暴露21 d的半致死濃度為3.2 mg·L-1，這表明有機次磷酸鹽對低等水生生物具有一定的毒性效應[5]。因此本實驗利用水生生物斑馬魚胚胎作為模型，初步探究了4種典型的DPs阻燃劑及其水解產物對斑馬魚胚胎死亡率、出膜率的影響。從化學結構來看，AMHP和CMHP具有相同的甲基環己基次膦酸基團和不同的金屬離子；而AMEP和ADEP的結構式與AMHP相比，具有相同的金屬離子和不同的烷基基團。因為溶解度限制，本實驗中CMHP的最高暴露濃度可達1 000 mg·L-1，而其他3種DPs的最高暴露濃度只能設為500 mg·L-1。

實驗結果顯示，AMHP和CMHP對斑馬魚胚胎毒性效應微弱。而AMEP和ADEP暴露能對斑馬魚胚胎產生一定的毒性效應，并具有明顯的劑量效應關系。與對照組比較，200 mg·L-1AMEP和ADEP暴露144 h后，胚胎死亡率顯著升高；500 mg·L-1AMEP和ADEP暴露48 h后，所有胚胎的出膜均被抑制，且胚胎死亡率極顯著升高。

據報道，在湖北云夢道橋鎮AMHP中試車間附近的土壤、河流表層沉積物、土壤泥芯等環境樣品均檢測到不同濃度的AMHP、AMEP和ADEP，同時在環境樣品還檢測到上述有機次磷酸鹽的水解產物——次膦酸，包括MHPA、甲基乙基次膦酸和二乙基次膦酸；這些結果表明有機次磷酸鹽類可以持久殘留在環境中，且易在環境條件下水解產生次膦酸；在被檢測的環境樣品中，有機次磷酸鹽及其降解產物次膦酸都表現出了相對較高的縱向遷移率和較低的水平遷移率，顯示有機次磷酸鹽可能會同時以次膦酸的形式污染地下水[6]。因此，我們對AMHP和CMHP的水解產物MHPA的毒性效應進行了研究。結果顯示，1 000 mg·L-1MHPA暴露組的胚胎從72 hpf開始，出膜率顯著降低、死亡率明顯上升。所以我們推測，CMHP、AMHP能通過水解為MHPA抑制斑馬魚胚胎的正常孵化，最終導致其死亡。現有文獻中報道的ADEP對大型蚤的慢性毒性效應[5]，也可能是其特定的水解產物二乙基次膦酸所造成的。

由于暫時無法獲得AMEP和ADEP相應的二烷基次膦酸水解產物，我們先使用1%鏈蛋白酶人工去除斑馬魚胚胎的卵膜，再對此無卵膜的胚胎進行AMEP和ADEP的暴露。結果表明，與未除卵膜時相比，各濃度AMEP和ADEP暴露組胚胎的死亡率明顯下降，雖然500 mg·L-1暴露組中無卵膜胚胎死亡率相對于對照組仍有極顯著差異，但從胚胎開始出現顯著死亡的時段來看，無卵膜胚胎比未除卵膜胚胎有所推遲，說明AMEP和ADEP暴露引起的斑馬魚胚胎死亡，是由于影響了胚胎正常出膜而導致的，但其致毒機理仍需進一步研究。

本研究首次比較研究了多種新型DPs阻燃劑及其水解產物對斑馬魚胚胎發育的毒性效應，發現DPs可能是通過其水解產物二烷基次膦酸抑制胚胎出膜，從而產生對其的毒性效應。從水生生物的角度，為DPs阻燃劑是否能作為溴化阻燃劑和傳統有機磷阻燃劑的替代品提供了一定的依據。

[1] Schecter A, Papke O, Tung K C, et al. Polybrominated diphenyl ether flame retardants in the US population: Current levels, temporal trends, and comparison with dioxins, dibenzofurans, and polychlorinated biphenyls [J]. Journal of Occupational and Environmental Medicine, 2005, 47 (3): 199-211

[2] Schreiber T, Gassmann K,G?tz C, et al. Polybrominated diphenyl ethers induce developmental neurotoxicity in a human in vitro model: Evidence for endocrine disruption [J]. Environmental Health Perspectives, 2010, 118 (4): 572-578

[3] Van der Veen I, De Boer J. Phosphorus flame retardants: Properties, production, environmental occurrence, toxicity and analysis [J]. Chemosphere, 2012, 88(10): 1119-1153

[4] Gao L H, Li W H, Shi Y L, et al. Analytical methods and pollution status of organophosphate flame retardants [J]. Environmental Chemistry, 2014, 33(10):1750-1761

[5] Waaijers S L, Bleyenberg T E, Arne D, et al. Daphnid life cycle responses to new generation flame retardants [J]. Environmental Science & Technology, 2013, 47(23): 13798-13803

[6] Niu Y M, Liu J F, Liang Y, et al. Aluminum dialkyl phosphinate flame retardants and their hydrolysates: Analytical method and occurrence in soil and sediment samples from a manufacturing site [J]. Environmental Science & Technology, 2014, 48(6): 3336-3343

[7] Goldsmith P. Zebrash as a pharmacological tool:The how, why, and when [J]. Current Opinion in Pharmacology, 2004, 4(5): 504-512

[8] Hill A J, Teraoka H, Heideman W, et al. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity [J]. Toxicological Sciences, 2005, 86: 6-19

[9] Deng J, Yu L Q, Liu C S, et al. Hexabromocyclododecane-induced developmental toxicity and apoptosis in zebrafish embryos [J]. Aquatic Toxicology, 2009, 93: 29-36

[10] Haanstra L, Doelman P, Voshaar J H O. The use of sigmoidal dose-response curves in soil ecotoxicological research [J]. Plant Soil, 1985, 84(2): 293-297

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Toxicity Effects of Four Kinds of Dialkyl Phosphinate Flame Retardants on Zebrafish (Daniorerio) Embryo

Chen Minjie1, Li Lisha2, Chen Fengjie2, Liu Yuchen1,*, Zhang Jie2, Liang Yong1,3,4, Liu Jiyan4

1. School of Medicine, Jianghan University, Wuhan 430056, China 2. Key Laboratory of Subtropical Agriculture & Environment, Ministry of Agriculture, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China 3. Institute of Environment and Health, Jianghan University, Wuhan 430056, China 4. Key Laboratory of Optoelectronic Chemical Materials and Devices, Ministry of Education, School of Chemical and Environmental Engineering, Jianghan University, Wuhan 430056, China

Received 30 November 2015 accepted 9 January 2016

The emerging organophosphorus flame retardants, dialkyl phosphinates (DPs), have been synthesized and used in large quantities. However, the toxicological study about them is rare. In this study, zebrafish is used as a model organism to investigate the toxicity effect of new DPs such as aluminum methylcyclohexy phosphinate (AMHP), calcium methylcyclohexyl phosphinate (CMHP), aluminum methylethyl phosphinate (AMEP) and aluminum diethyl phosphinate (ADEP) on aquatic organisms. The results showed that AMHP and CMHP had no significant toxic effects on zebrafish embryo, while high concentrations of AMEP and ADEP have a certain impact on zebrafish embryo. AMEP and ADEP of 500 mg·L-1can significantly increase the mortality of zebrafish embryo, and decrease the rate of the hatching rate. We also studied methylcyclohexy phosphinate acid (MHPA), the hydrolysate of AMHP and CMHP, and found that MHPA of 1 000 mg·L-1exposure increased zebrafish embryo mortality while decreased its hatching rate. Furthermore, we compared the effect of DPs on normal zebrafish embryo and chorion-free zebrafish embryo. The results showed that the mortality is largely decreased after removing chorion. Thus, we speculate that the toxic effects of DPs on zebrafish embryo might be caused by DP’s hydrolysate, and the chorion might be the direct target. These results provide evidence that dialkyl phosphinates could be a used as preeminent substitute for brominated flame retardants and traditional organophosphorus flame retardants.

dialkyl phosphinates; dialkyl phosphinate acid; zebrafish embryo; toxicity effects

10.7524/AJE.1673-5897.20151130009

國家自然科學基金(21407063，21277062)；武漢市晨光科技計劃(2013071004010474)；環境化學和生態毒理學國家重點實驗室開放基金(KF2012-18，KF2013-08)；江漢大學人才啟動基金(2012031)

陳敏杰(1986-)，女，助理實驗師，研究方向為環境毒理學，E-mail: chenminjie@jhun.edu.cn

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: yuchen.liu@jhun.edu.cn

2015-11-30 錄用日期：2016-01-09

1673-5897(2016)2-687-06

X171.5

A

簡介：劉鈺晨(1982—)，女，博士，講師，主要研究方向環境毒理學，目前已發表SCI論文10余篇。

陳敏杰, 黎麗莎, 陳馮杰, 等. 4種二烷基次膦酸鹽阻燃劑對斑馬魚胚胎的毒性研究[J]. 生態毒理學報，2016, 11(2): 687-692

Chen M J, Li L S, Chen F J, et al. Toxicity effects of four kinds of dialkyl phosphinate flame retardants on zebrafish (Danio rerio) embryo [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 687-692 (in Chinese)