鉛對人Bel-7402肝癌細胞毒性及EGFP基因DNA甲基化的影響

吳家兵，楊永堅，王先良，葉丹，楊文靜，錢巖，呂占祿，郭辰，梁豹，趙淑莉

1. 安徽醫科大學公共衛生學院勞動衛生與環境衛生系，合肥 230032 2. 中國環境科學研究院環境基準與風險評估國家重點實驗室，北京 100012 3. 中國疾病預防控制中心環境與健康相關產品安全所，北京 100050 4. 中國環境監測總站，北京 100029

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鉛對人Bel-7402肝癌細胞毒性及EGFP基因DNA甲基化的影響

吳家兵1,2，楊永堅1,*，王先良2,3,#，葉丹3，楊文靜3，錢巖2，呂占祿2，郭辰2，梁豹1,2，趙淑莉4

1. 安徽醫科大學公共衛生學院勞動衛生與環境衛生系，合肥 230032 2. 中國環境科學研究院環境基準與風險評估國家重點實驗室，北京 100012 3. 中國疾病預防控制中心環境與健康相關產品安全所，北京 100050 4. 中國環境監測總站，北京 100029

以體外培養人Bel-7402肝癌細胞為模型，研究鉛的3種常見化合物氯化鉛(PbCl2)、乙酸鉛(Pb(CH3COO)2)、硝酸鉛(Pb(NO3)2)的細胞毒性和去甲基化表觀遺傳毒性。應用MTS方法檢測細胞的存活率，以前期研究建立的評價方法評價鉛化合物的去甲基化表觀遺傳毒性。結果顯示，PbCl2、Pb(CH3COO)2、Pb(NO3)2均會抑制Bel-7402細胞的增值，計算求得PbCl2、Pb(CH3COO)2、Pb(NO3)2相應的50%細胞存活濃度(IC50)值分別為2 524 μmol·L-1、1 977 μmol·L-1、1 899 μmol·L-1；80%細胞存活濃度(IC80)值分別為264 μmol·L-1、221 μmol·L-1、281 μmol·L-1，通過對3種染毒物不同染毒濃度的細胞存活率進行隨機區組設計的方差分析顯示3種化合物間的差異無統計學意義(F= 0.11；P= 0.897)。去甲基化表觀遺傳毒性檢測結果顯示，PbCl2、Pb(CH3COO)2、Pb(NO3)2均可觀察到明顯的去甲基化表觀遺傳毒性，其相對于5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)的去甲基化表觀遺傳毒性當量分別為2.82E-03、1.50E-03、5.09E-04，三者間也無顯著性差異。結果表明，鉛化合物會使Bel-7402細胞的細胞存活率和轉染進細胞的質粒上增強型綠色熒光蛋白基因啟動子的DNA甲基化水平下降。

鉛；Bel-7402細胞；去甲基化；MTS

Received 23 September 2015 accepted 28 October 2015

環境化合物引起的健康損害與表觀遺傳損傷關系密切，表觀遺傳毒性是化學品安全性評價的新問題[1]。研究發現許多通過現有安全性評價檢測的化合物，沒有發現存在基因突變、染色體畸變等遺傳學損傷能力，卻依然可以通過表觀遺傳學機制對人類產生深遠影響[2]。而鉛作為環境中普遍存在的有毒重金屬，可造成人體多種組織和器官的損害，低劑量接觸就可引起各種亞臨床改變如阿爾茲海默病[3]、精神發育遲滯等[4]。有研究顯示我國兒童鉛暴露所致精神發育遲滯的發病率遠高于西太平洋地區的平均水平[5]。因此，評價鉛及其化合物的表觀遺傳毒性是其安全性評價面臨的新問題。近年來，隨著檢測技術的發展，國內外學者對鉛暴露誘發的表觀遺傳學改變，特別是致DNA甲基化異常的研究取得了一些進展，但對其致基因組DNA甲基化改變大小的定量評價還未見報道[6]。而不管是體內實驗還是體外實驗，了解環境化學物對于人類甲基化水平的作用能力大小，對豐富化學物的潛在毒性評價信息以及安全性評價體系的建立和標準的制定均有重要的參考價值。有專家已經開始認識到定量檢測環境化合物去甲基化表觀遺傳毒性的重要性[7-8]。

本研究中我們選擇了3種鉛的常見化合物乙酸鉛、硝酸鉛、氯化鉛為研究對象，以體外培養人Bel-7402肝癌細胞為模型。分別應用MTS方法檢測細胞的存活率和通過前期研究建立的化學物去甲基化表觀遺傳毒性評價方法(簡稱QDMP)[9-12]檢測其去甲基化表觀遺傳毒性，去甲基化表觀遺傳毒性評價結果以去甲基化藥物5-Aza-CdR的濃度當量表示。該方法是將pEGFP-C3質粒通過人工甲基化處理，獲得綠色熒光蛋白基因啟動子區處于高甲基化狀態的C3質粒，并將其轉染進人類Bel-7402肝癌細胞株，隨后以該細胞株為載體，與染毒液進行共培養，依據細胞綠色熒光強度來定量評價去甲基化功能的強弱，是對污染物表觀遺傳毒性評價技術的新探索。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

主要儀器：BIO-PRINT008型凝膠成像系統(Vilberlo urmat，法國)；高速離心機(Sigma 3K30 centrifuge，Sigma，美國)；流式細胞儀(Bechman Coulter Altra，美國)；水套式CO2細胞培養箱(Thermo，美國)；生物安全柜(Thermo，美國)；Model680酶聯免疫檢測儀(Bio-RAD，美國)；IX71型熒光倒置顯微鏡(Olympus，日本)；

主要試劑：Bel-7402細胞株和大腸桿菌DH5α感受態細胞由北京工業大學提供；Plasid maxi kit試劑盒(QIAGEN，美國)；DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0(Sigma，美國)；p-EGFP-C3質粒(Sigma，美國)；乙酸鉛、硝酸鉛、氯化鉛(分析純，中國西亞試劑公司)；DNA甲基化酶M.SssI、HpaII酶、MspI酶(New England Biolabs公司，美國)；X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent(Roche，美國)；500～7 500 bp DNA Marker(北京天根公司)。

1.2 鉛化合物的細胞毒性檢測

1.2.1 MTS實驗

獲取處于對數生長期生長良好的Bel-7402細胞，以每孔2×104個細胞接種于96孔板，每孔100 μL進行細胞鋪板培養。移入細胞培養箱中以37 ℃、5% CO2條件培養，待細胞匯合度達80%～90%時進行細胞染毒。將已配好的終濃度染毒溶液臨用前超聲5 min，用無血清培養基配制所需各濃度的染毒液于1 mL EP管中(根據預實驗和相關文獻[13-15]將染毒濃度定為0、50、100、200、400 μmol·L-1)，棄去培養板中原培養液，以100 μL每孔加入已配好的各濃度染毒液，每個染毒濃度設6個平行樣，染毒培養24 h。細胞染毒結束前1 h以20 μL每孔加入MTS，而后用錫箔紙包好置于細胞培養箱內，繼續培養1 h后用酶聯免疫檢測儀在490 nm波長下測吸光度。

1.2.2 數據分析處理

對各染毒化合物進行MTS實驗后，計算細胞存活率(細胞存活率=(OD實驗組-OD調零孔)/(OD對照孔-OD調零孔)×100%)。而后參考趙斌等[16]和王姍姍等[17]提到的方法，應用SPSS軟件求得PbCl2、Pb(CH3COO)2、Pb(NO3)2的半數抑制濃度IC50和80%抑制濃度IC80。

1.3 鉛化合物的去甲基化能力檢測

1.3.1 高甲基化pEGFP-C3質粒的獲取

(1) pEGFP-C3質粒的擴增：參照江艷等[18]使用的方法對質粒進行擴增。(2) pEGFP-C3質粒的提取：依據Plasid maxi kit試劑盒(QIAGEN)的操作說明對擴增好的質粒進行提取。(3) pEGFP-C3質粒的甲基化修飾及純化：參照甲基化酶M.SssI說明書(New England Biolabs)對提取好的質粒進行甲基化修飾處理，并用HpaⅡ酶切檢測甲基化修飾處理效果，未甲基化DNA雙鏈的去除和甲基化DNA的純化按照Wang等[19]和MicroElute DNA Clean-Up Kit試劑盒(OMEGA)的操作說明進行。最后用微量分光光度計測定C3質粒的濃度，-20 ℃冷藏備用。1.3.2 高甲基化的pEGFP-C3質粒轉染Bel-7402細胞株

Bel-7402細胞傳代培養后，轉入24孔培養板培養(鋪板密度為每毫升2.0×105個細胞)，每孔加500 μL含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖培養基培養，待細胞匯合度達80%～90%時，根據X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent轉染試劑盒說明書(Roche)，Fugene HD和甲基化C3質粒以3:1比例配制轉染試劑混合物。每孔加入相應轉染試劑混合物50 μL，轉染6 h。

1.3.3 以經高甲基化pEGFP-C3質粒轉染的Bel-7402細胞株為受試對象進行染毒

細胞轉染6 h后進行染毒。根據MTS實驗的結果確定各化合物的染毒濃度為3.125、12.5、50、200 μmol·L-1，每個濃度設3個平行孔。同時每組實驗中均要以5-Aza-CdR為陽性受試物進行細胞梯度劑量共培養染毒處理，用以繪制標準曲線，通過前期實驗[10]確定5-Aza-CdR的染毒濃度為 0、0.00016、0.0008、0.004、0.02、0.1 μmol·L-1，每個濃度同樣設3個平行孔。細胞染毒時間均為24 h。

1.3.4 細胞染毒后的熒光差異檢測

胰酶消化細胞，離心棄掉上清液后用冷的PBS重懸細胞2次，經300目篩網過濾后移至流式管，用CELL Quest軟件進行流式細胞術檢測分析。

1.3.5 基于5-Aza-CdR染毒標準曲線的制作

對染毒濃度為0、0.00016、0.0008、0.004、0.02、0.1 μmol·L-1的5-AZA-CdR進行流式熒光檢測，獲得各濃度的熒光陽性細胞比例，再求出各濃度相對于空白對照孔增加的熒光陽性細胞比例，以所得值為縱坐標、相應染毒濃度為橫坐標繪制標準曲線。以相同方法獲得各重金屬化合物相對于空白染毒孔增加的熒光陽性細胞比例，將此值作為y值代入標準曲線方程中求出相應的x，以此x除以其對應的重金屬化合物濃度所得值即為各重金屬化合物相應濃度去甲基化能力相對于5-AZA-CdR的當量值。最后計算它們的幾何均數，所得結果即是各重金屬化合物去甲基化能力相對于5-AZA-CdR的當量值。

1.4 分析方法

數據采用SPSS for windows 10.0進行均數檢驗、相關分析、回歸分析等統計處理，曲線擬合采用Excel軟件。

圖1 C3質粒甲基化處理效果檢測注：1，陰性對照；2，未甲基化處理質粒MspΙ酶切；3，未甲基化處理質粒HpaⅡ酶切；4，甲基化處理質粒MspΙ酶切；5，甲基化處理質粒HpaⅡ酶切；6，DNA Marker。Fig. 1 Methylation effects for C3 plasmidNote: 1. negative control; 2. unmethylation control; 3. unmethylation control; 4. methylated plasmid of enzyme by MspΙ; 5. methylated plasmid of enzyme by HpaⅡ; 6. DNA marker.

2 結果(Results)

2.1 pEGFP-C3質粒甲基化處理效果

由圖1可見，未甲基化處理的質粒分別經HpaII和MspI酶切后電泳呈現涂抹現象，甲基化處理的質粒經MspI酶切后電泳呈涂抹現象，而經HpaⅡ酶切后與未經酶切的DNA一樣均呈單一條帶，提示經甲基化處理的質粒處于甲基化狀態。HpaII和MspI酶切效果比對甲基化處理完全。提示經甲基化處理的質粒處于甲基化狀態。

2.2 細胞毒性實驗結果

根據前面提到的方法分別計算出各化合物各染毒濃度的細胞存活率后發現，隨著染毒濃度的增加，Bel-7402細胞的細胞存活率均呈現下降的趨勢，并與染毒濃度間有良好的線性關系，表明鉛的這3種化合物均會抑制Bel-7402細胞的增值。應用SPSS軟件求得PbCl2、Pb(CH3COO)2、Pb(NO3)2的IC50值分別為2 524、1 977、1 899 μmol·L-1，IC80值分別為264、221、281 μmol·L-1。通過對3種染毒物不同染毒濃度的細胞存活率進行隨機區組設計的方差分析顯示3種化合物間的差異無統計學意義(F= 0.11；P= 0.897)，詳細結果見圖2。根據本實驗結果，為保證具有適當的細胞存活率，選擇細胞存活率在80%以上的濃度作為各個鉛化合物的染毒劑量，分別是3.125、12.5、50、200 μmol·L-1。

圖2 鉛的3種化合物PbCl2、Pb(CH3COO)2、Pb(NO3)2對Bel-7402細胞存活率的影響Fig. 2 Changes in cell viability in Bel-7402 cells after exposure to lead compounds PbCl2，Pb(CH3COO)2，Pb(NO3)2

圖3 代表性5-Aza-CdR流式細胞綠色熒光檢測圖注：從左到右各圖的5-Aza-CdR濃度分別為0、0.00016、0.0008、0.004、0.02、0.1 μmol·L-1。Fig. 3 Representative radiograph of detection effect on green fluorescence of flow cytometryNote: The exposure dose of 5-Aza-CdR from left to right were 0, 0.00016, 0.0008, 0.004, 0.02, 0.1 μmol·L-1.

2.3 各染毒化合物的去甲基化情況

2.3.1 5-Aza-CdR染毒標準曲線制作

依據上述方案用CELL Quest軟件，以DNA熒光寬度為橫坐標，GFP熒光陽性率為縱坐標(擬定對照組80%百分位數的GFP強度為GFP表達陽性基準)，進行流式細胞術檢測分析(檢查通道為FL1，設置為log)。得出2組甲基化能力測試5-Aza-CdR染毒標準曲線方程分別為y= 0.279ln(x) +4.764和y= 0.314ln(x) +9.285，其代表性5-Aza-CdR流式細胞綠色熒光檢測圖及相應標準曲線如圖3及圖4所示。結果顯示，5-Aza-CdR各染毒組的熒光陽性細胞比例均高于空白對照組，且隨著染毒濃度的上升，各組的熒光陽性細胞比例也隨之上升，呈現良好的對數線性關系。

圖4 代表性5-Aza-CdR流式細胞綠色熒光檢測標準曲線Fig. 4 Representative graph of 5-Aza-CdR exposure standard curve for detection by green fluorescence of flow cytometry

2.3.2 鉛化合物的表觀遺傳毒性檢測結果

通過檢測后發現，在熒光陽性細胞比例方面，PbCl2、Pb(NO3)2、Pb(CH3COO)2的各染毒濃度組熒光陽性細胞比例均高于空白對照組，但各染毒濃度組間的比較顯示均無顯著性差異，表明鉛的這3種化合物在所研究的濃度范圍內均具有去甲基化表觀遺傳毒性。在相對于5-Aza-CdR的去甲基化當量方面，如表1所示，在(3.125～200) μmol·L-1的染毒濃度范圍內，Pb(CH3COO)2的去甲基化表觀遺傳毒性當量介于8.15E-05～4.85E-03的5-Aza-CdR之間；Pb(NO3)2去甲基化表觀遺傳毒性當量介于7.08E-05～2.84E-02的5-Aza-CdR之間；PbCl2去甲基化表觀遺傳毒性當量介于2.17E-04～2.15E-01的5-Aza-CdR之間。這3種染毒物去甲基化當量幾何均值從小到大依次為PbCl2> Pb(NO3)2> Pb(CH3COO)2。通過對這3種染毒物的去甲基化表觀遺傳毒性當量值進行方差分析后顯示，F= 0.855，P= 0.457。表明鉛的3種化合物相對于5-Aza-CdR的去甲基化當量之間的差異沒有顯著性。

3 討論(Discussion)

開展環境污染物的毒性效應綜合評價是未來環境污染管理不可避免的關鍵科學問題，到目前為止，已經開展的健康危害評價涵蓋急性毒性評價和慢性毒性評價等方面。而以去甲基化能力為代表的表觀遺傳毒性則并沒有得到足夠重視，但這種新型的表觀遺傳毒性在環境中更為廣泛，比“三致”毒性更容易出現[20]。因此，評價環境化合物的去甲基化能力是化學品安全性評價面臨的新問題，有專家已經開始認識到定量檢測去甲基化表觀遺傳毒性的重要性[7-8]。

表1 各化合物相對于5-Aza-CdR的去甲基化當量情況

Table 1 Toxic equivalent quantity of each compounds (based on 5-Aza-CdR demethylation)

注：Pb(NO3)2、Pb(CH3COO)2組所對應的5-Aza-CdR標準方程為y = 0.279ln(x) +4.764，R2=0.946；PbCl2組對應的標準方程為y = 0.314ln(x) +9.285，R2= 0.883。

Note:The corresponding 5-Aza-CdR standard equation of Pb(NO3)2and Pb(CH3COO)2are “y = 0.279ln(x) +4.764, R2=0.946”; the corresponding 5-Aza-CdR standard equation of PbCl2is “y = 0.314ln(x) +9.285, R2= 0.883”.

鉛是一種在細胞內不能被代謝轉化降解的有毒重金屬，但其可與DNA形成加合物，從而對細胞產生影響。在細胞研究方面，徐進等[21]發現鉛能導致大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞損傷，包括細胞凋亡率和壞死率的增加；王秋菊等[15]發現鉛可致C2C12成肌細胞發生凋亡損傷；還有研究顯示鉛暴露會抑制神經細胞SH-SY5Y的增值[22]。本研究應用體外培養Bel-7402細胞從DNA甲基化改變和凋亡損傷的角度闡釋了鉛對癌細胞的損害作用。通過比較發現，在相同染毒濃度時，Bel-7402肝癌細胞的細胞存活率均高于上述幾種非癌細胞。

近年來，隨著DNA甲基化檢測技術的持續發展和不斷完善，越來越多的體外細胞試驗、動物試驗及人群流行病學研究表明，鉛暴露會改變基因組DNA和某些基因啟動子區胞嘧啶的甲基化水平[6]。本次實驗以人Bel-7402肝癌細胞為載體，通過以5-Aza-CdR為參照標準，獲得了鉛的這3種化合物相對于5-Aza-CdR的去甲基化能力當量值，實驗中經過鉛化合物染毒后，染毒組的熒光陽性細胞比例均低于空白對照組，表明鉛暴露可使重組Bel-7402細胞中質粒上EGFP基因啟動子的甲基化水平降低，顯示其去甲基化表觀遺傳毒性。但與濃度間并無良好的線性關系，這與王麗君[22]和Rossiello等[23]的細胞研究結果類似。而通過對它們的細胞抑制率和去甲基化能力當量值的比較發現，各化合物間并無顯著性差異，提示鉛的各化合物對細胞增殖的影響和去甲基化能力大小可能并不隨其陰離子類型的變化而產生顯著性的改變。

研究進一步豐富了人們對鉛化合物毒性的認識，對安全性評價體系的建立和標準的制定也有重要的參考價值。但本實驗中僅對單一鉛化合物的細胞毒性及表觀遺傳改變進行了研究，而環境中的污染狀況多以多種污染物并存的復合污染為主，所以探究多種污染物并存的復合表觀遺傳毒性還有待我們進一步研究。

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Lead Toxicity to Human Liver Cancer Cells Bel-7402 and Their Effect on DNA Methylation Levels at Promoter Region of EGFP Gene

Wu Jiabing1,2, Yang Yongjian1,*, Wang Xianliang2,3,#, Ye Dan3, Yang Wenjing3, Qian Yan2, Lv Zhanlu2, Guo Chen2, Liang Bao1,2, Zhao Shuli4

1. School of Public Health, Anhui Medical University, Hefei 230032, China 2. State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China3. Institute of Environmental Health and Related Product Safety, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100050, China 4. China National Environmental Monitoring Center, Beijing 100029, China

Human liver cancer Bel-7402 cells were used to estimate the cell toxicity and demethylation toxicity of 3 lead compounds including lead chloride (PbCl2), lead acetate (Pb(CH3COO)2) and lead nitrate (Pb(NO3)2). Cell viability was estimated firstly by MTS assay, and the demethylation toxicity of lead compounds was quantified by the method established and reported in earlier study. The results showed PbCl2, Pb(CH3COO)2and Pb(NO3)2all significantly inhibited the Bel-7402 cell proliferation and the IC50values were 2 524 μmol·L-1, 1 977 μmol·L-1, 2 524 μmol·L-1; the IC80values were 264 μmol·L-1, 221 μmol·L-1, 281 μmol·L-1. There was no significant difference of cell viability among 3 cell groups treated with different lead compounds (F= 0.11; P= 0.897). However significant epigenetic demethylation toxicity was observed for 3 compounds and their demethylation toxicity equivalency was 2.82E-03, 1.50E-03 and 5.09E-04 folds of 5-AZA-CdR, respectively. No significant difference was observed among their demethylation toxicity equivalency. The study revealed that lead compounds can inhibit Bel-7402 cell proliferation and induce obvious demethylation effect on DNA methylation levels at promoter region of EGFP gene.

lead; Bel-7402 cells; demethylation; MTS

10.7524/AJE.1673-5897.20150923001

國家環保公益性行業科研專項(201309045)；國家自然科學基金(20907047)；國家重點基礎研究發展(973)計劃(2012CB525005)

吳家兵(1989-)，男，碩士研究生，研究方向為職業環境毒理學，E-mail：wujiabing159@sina.cn

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: yyj580719@163.com

2015-09-23 錄用日期：2015-10-28

1673-5897(2016)2-708-07

X171.5

A

簡介：楊永堅(1958-)，男，學士，教授，主要從事環境與職業衛生研究，公開發表學術論文50余篇。

吳家兵, 楊永堅, 王先良, 等. 鉛對人Bel-7402肝癌細胞毒性及EGFP基因DNA甲基化的影響[J]. 生態毒理學報，2016, 11(2): 708-714

Wu J B, Yang Y J, Wang X L, et al. Lead toxicity to human liver cancer cells Bel-7402 and their effect on DNA methylation levels at promoter region of EGFP gene [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 708-714 (in Chinese)

# 共同通訊作者(Co-corresponding author )， E-mail: xlwang@craes.org.cn