維藥野西瓜對膠原誘導型關節炎大鼠模型的治療機制研究

李培奇 周文濤 娜爾給扎·艾爾肯

【摘 要】 目的：通過膠原型誘導型關節炎（CIA）大鼠模型，初步研究維藥野西瓜對類風濕性關節炎的抗炎機制。方法：構建II型膠原誘導型關節炎大鼠模型，觀察維藥野西瓜治療前后CIA大鼠足踝腫脹程度及踝關節組織病理的改變；ELISA法檢測大鼠血清中TNF-α表達水平的變化；免疫組化法檢測大鼠足踝關節組織中TNF-α的表達。結果：維藥野西瓜可有效緩解CIA大鼠關節的腫脹情況，減緩組織炎癥發展；藥物作用25d后，與模型組血清中TNF-α含量（608±135）ng/mL相比，維藥野西瓜處理組血清中TNF-α的含量（439±26）ng/mL明顯降低；與模型組相比，維藥野西瓜治療組大鼠足踝關節組織中TNF-α的表達也明顯減少。結論：維藥野西瓜對CIA大鼠具有較好的抗RA作用，其作用機制可能與降低血清及組織中的TNF-α水平有關。

【關鍵詞】 類風濕性關節炎；維藥野西瓜；CIA大鼠模型；TNF-α

【中圖分類號】R59322 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2016）20-0009-04

類風濕性關節炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種以累積周圍關節為主的多系統慢性炎癥性自身免疫疾病，可導致不可逆的關節軟骨和骨破壞，甚至關節畸形和殘疾[1]。RA的發病機制至今仍未證實，近年來研究顯示RA的發病機制可能與感染、遺傳和內分泌等有關，但臨床上依然缺乏特異性治療措施，尚無治愈方法。維藥野西瓜（Capparis Spinosal）廣泛分布于新疆天山南北，其為新疆維吾爾醫治療類風濕性關節炎、痛風及瘡毒等疾病的外敷用藥，具有祛風除濕，止痛消痛的作用。研究通過構建大鼠Ⅱ型膠原誘導型關節炎模型（Type Ⅱ Collagen Induced Arthritis，CIA），觀察維藥野西瓜外敷法對CIA型關節炎大鼠左足踝關節腫脹程度、組織病理、細胞因子TNF-α在血清與組織中的表達，對維藥野西瓜抗膠原型關節炎大鼠模型的效果及作用機制進行初步探討。

1 儀器與材料

11 動物 清潔級雌性Wistar大鼠40只，7～9周齡，體重（200±15）g，由新疆醫科大學實驗動物中心提供。

12 儀器 游標卡尺（最小刻度為02mm，上海精密儀器廠）； Labsystems Dragon wellscanMK3酶標儀。

13 材料 維藥野西瓜（新疆新特藥有限公司提供，新疆醫科大學藥學院生藥系鑒定）；雷公藤多甙片（批號：140701，上海復旦復華藥業有限公司）；酸溶性型牛Ⅱ膠原（美國Sigma公司）；弗氏完全佐劑（Freunds Complete Adjuvent，FCA，美國Sigma公司）；ELISA大鼠TNF-α定量試劑盒（ebioscience公司）；anti-TNF-α抗體（武漢博士德公司）；DAB顯色試劑盒（北京金杉公司）。

2 方法

21 動物模型的分組、構建及給藥 將40只Wistar雌性大鼠隨機分為4組：空白對照組（NS）、模型組、雷公藤甙治療組及野西瓜治療組。根據參考文獻[2]，配制IFA：完全佐劑 （FCA）石蠟=1∶[KG-*3/5]2，造模前模型組將酸溶性型牛Ⅱ膠原與IFA等體積進行混合、乳化。在大鼠左側后足跖肉墊處皮內注射 01mL混懸乳劑致敏，背部皮內注射005mL混懸乳劑致敏，每天測量足趾腫脹程度，7d后在鼠尾根部注射相同乳劑加強1次。正常對照組在相同的部位注射 01mL滅菌石蠟。致敏2周后，成功建立CIA型關節炎大鼠模型，參照關節炎指數評分標準[3]對模型復制效果進行評估，評分達6分以上的大鼠用于實驗。陽性對照組給予雷公藤甙（001mg/kg）灌胃治療；治療組為維藥野西瓜粗提取物加白酒及蛋清混勻（45°白酒∶[KG-*3/5]蛋清=1∶[KG-*3/5]2，5%維藥野西瓜打粉粗提物），用紗布包裹于大鼠左后足踝進行治療，隔日一次換藥；正常對照組及模型組以生理鹽水灌胃，每日一次。

22 取材 治療25d后取材，處死大鼠，采取大鼠腹主動脈采血，將其左右足踝關節的滑膜組織用10%甲醛溶液進行固定。

23 觀察檢測 用游標卡尺每日測量大鼠左后足踝關節的上下徑并記錄數據，觀察其腫脹程度（精確至02mm）；同時鏡下觀察大鼠左后足踝關節滑膜組織病理切片（HE染色）變化，ELISA法觀察血清中TNF-α的變化，免疫組化法觀察足踝關節組織TNF-α的表達水平。

24 免疫組化結果評分 采取每張切片隨機觀察具有代表性的10個高倍鏡視野，根據胞膜胞質染色程度及染色細胞百分比進行評分：基本不著色者為0分，著色淡者為1分，著色適中者為2分，著色深者為3分；著色細胞占計數細胞百分比≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。將每張切片著色程度得分與著色細胞百分比得分相乘為其最后得分，0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），≥4分為強陽性（++）。

25 統計學方法 采用統計軟件SPSS170進行數據分析，用均數加減標準差（x[TX-*3]±s）表示，計量資料經方差齊性檢驗，方差齊則采用方差分析的方法，兩兩比較采用SNK法；等級資料進行Kruskal-Wallis H test秩和檢驗；方差不齊，則采用秩和檢驗。P<005表示差異有統計學意義。

3 結果

31 對CIA大鼠足踝關節腫脹程度的影響 維藥野西瓜對CIA大鼠踝關節的急性炎癥反應有較好抑制作用。與空白對照組比較，造模后第14天（藥前）各組踝關節均明顯腫脹（P<001），表明造模成功。用藥第25天后，雷公藤甙組及維藥野西瓜對大鼠右足踝關節腫脹均有明顯的緩解作用（P<005）。

32 組織病理切片觀察 HE染色組織切片鏡下可見，正常組大鼠關節組織無淋巴細胞浸潤及毛細血管的增生；CIA大鼠模型組可見到淋巴細胞浸潤，同時滑膜細胞增殖，毛細血管的增生，軟骨組織破壞嚴重；而雷公藤甙治療組和維藥野西瓜外敷組鏡下觀察可見軟骨組織破壞減輕，淋巴細胞浸潤明顯改善。見圖1～4。

33 外周血中TNF-α含量變化 由圖5可知，與正常對照組外周血中TNF-α含量（518±101）ng/mL比較，模型組大鼠外周血中TNF-α含量（608±135）ng/mL明顯升高，差異有統計學意義（t=-2582，P<005）。雷公藤甙治療組大鼠外周血中TNF-α含量為（475±74）ng/mL、維藥野西瓜治療組大鼠外周血中TNF-α含量為（439±26）ng/mL，均明顯低于模型組，差異有統計學意義（t值分別為-3265、-2601，P<005）。

34 足踝關節組織中TNF-α表達水平變化 由圖6可見，CIA關節炎大鼠模型組足踝關節組織中TNF-α表達明顯升高（Z=-300，P<005）。與模型組相比，雷公藤甙治療組及維藥野西瓜治療組大鼠踝關節組織中TNF-α表達水平明顯下降（Z值分別為-2449、-2362，P<005）。

4 討論

類風濕性關節炎的臨床表現主要為關節滑膜慢性炎癥反應，該病具有診斷不易，易反復發作的特點。治療不佳的患者可隨著病情發展，逐漸侵害關節，直至關節畸形，甚至功能喪失，因此早期干預有利于延緩病情進展，對改善患者預后具有重要意義[2]。RA從組織病理變化上而言可能涉及關節腔滑膜炎癥、細胞增生、炎性細胞浸潤、肉芽腫形成、軟骨及骨組織破壞等多個環節，目前尚無特效治療措施[3]。

維吾爾醫藥用植物野西瓜，因多分布于新疆南北坡地而最早報道于《新疆中草藥》，其維文名為：開派、菠里科果，在沙特阿拉伯做為傳統藥物常被用作治療風濕病、關節炎和痛風等；在維吾爾醫學中，野西瓜被認為具有祛風除濕、散寒除濕、消腫止痛的功效，常被作為治療類風濕性關節炎的藥物。近年來，野西瓜經過粗提取后的臨床應用已引起國內外研究者的關注。有研究已表明[4]，維藥野西瓜可緩解佐劑型關節炎大鼠的關節腫脹，降低外周炎性因子的水平。Ⅱ型膠原誘導型關節炎模型（type Ⅱ collagen induced arthritis）由Trentham等于1977年首次建立，并隨研究的不斷深入和相關實驗的大量重復，目前已成為公認的研究人類類風濕關節炎的經典模型[5]。CIA模型在病證表現性更加的穩定、持久[6]，并更接近于人類的RA模型，具有研究的代表性和經典性。實驗依據參考文獻[2]，免疫2周后成功構建CIA大鼠模型。參照關節炎指數評分標準[7]對模型的復制效果進行評估，評分達6分以上。結果顯示：與對照組比較，造模后第2周（給藥前）各組踝關節均明顯腫脹，CIA大鼠模型制備較為成功（P<001）。藥物干預第25天時，模型組CIA大鼠足踝關節直徑為（1005±05）mm，雷公藤治療組及野西瓜治療組大鼠足踝關節的腫脹程度明顯減輕，分別為（933±08）mm、（872±07）mm，差異具有統計學意義（P<005）。從組織切片上也可以看出，野西瓜治療組大鼠軟骨組織破壞減輕，淋巴細胞浸潤得到明顯改善。

腫瘤壞死因子（TNF-α）通常由單核細胞及巨噬細胞分泌。做為主要前炎癥因子，TNF-α對關節實質細胞和內皮細胞具有廣泛作用，在形成RA炎癥、新生血管生成和骨質減少過程中起著重要作用[8]：TNF-α可促進趨化因子的合成和分泌、增加細胞黏附分子的表達，從而加速淋巴細胞和單核細胞的募集[9]。TNF-α也可促進提呈抗原肽的MHCⅡ類分子表達，通過促進對自身抗原的反應激活T細胞，繼而誘導結締組織細胞，包括滑膜成纖維細胞和軟骨細胞產生前列腺素E2（PGE2）和基質金屬蛋白酶（MMP），致滑膜炎癥和增生、軟骨破壞[10]。TNF-α還可促進 RA滑膜細胞的凋亡[10]。有研究顯示RA患者血和病變關節滑液中 TNF-α水平隨同期關節炎活動指數的改善而顯著下降，使用抗 TNF-α單抗治療后，RA患者病變關節內的滑膜炎和軟骨破壞得以抑制，患者癥狀體征明顯減輕[10]。實驗中利用ELISA實驗及免疫組化實驗，試圖從血清學水平及組織學水平上分別對CIA大鼠血清及組織中TNF-α的表達情況進行檢測。結果顯示，藥物處理25天后，正常對照組血清中TNF-α含量為（518±101）ng/mL，CIA模型組大鼠血清中TNF-α為（608±135）ng/mL，與正常組相比明顯升高，且差異有統計學意義（P<005）；雷公藤甙治療組大鼠外周血中TNF-α為（475±74）ng/mL，維藥野西瓜治療組為（439±26）ng/mL，與CIA模型組相比，兩者均明顯降低（P<005），但兩者之間差異無統計學意義。結果提示維藥野西瓜可通過降低CIA大鼠血清中TNF-α水平起到抗RA的作用。免疫組化技術是利用抗原抗體特異性反應對組織細胞中的特定抗原（或抗體）進行定位和定性的一種染色技術，具有直觀的特點。免疫組化實驗結果顯示CIA模型組大鼠在關節滑膜組織上TNF-α表達明顯增高 （P<005）；與模型組相比，雷公藤甙治療組及維藥野西瓜治療組大鼠踝關節組織中TNF-α表達水平明顯下降 （P<005）。ELISA及免疫組化實驗結果提示抑制血清及足踝關節組織中TNF-α的表達可能是維藥野西瓜抗類風濕性關節炎的作用機制之一。

綜上所述，維藥野西瓜可有效減輕CIA大鼠模型的足趾腫脹程度，緩解病理損害，其機制可能與降低血清及組織中的TNF-α水平有關。RA 的發病機制目前尚未明確，臨床治療手段較局限，通過現代的研究手段和方法運用，來發掘特色維藥的獨特治療效果，有利于進一步研究并闡明維藥野西瓜在抗類風濕關節炎中的作用及機制，以期在類風濕性關節炎的研究及診治上取得新進展。

參考文獻

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（編輯：陶希睿）