U PLC同時測定腦安顆粒中6種人參皂苷類成分的含量

胡紫艷　孫夏榮　史達　朱穎　蔣健

（南京市食品藥品監督檢驗院，江蘇 南京210000）

U PLC同時測定腦安顆粒中6種人參皂苷類成分的含量

胡紫艷孫夏榮史達朱穎蔣健

（南京市食品藥品監督檢驗院，江蘇 南京210000）

目的：采用超高效液相色譜法（UPLC）分離測定腦安顆粒中 6種人參皂苷的含量。方法：采用ACQUITY BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱，流動相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫，流速0.45 mL/min，檢測波長203 nm，柱溫35℃。結果：6種人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3和Rd分別在8.096～ 202.4，20.008～500.2，16.112～ 402.8，8.24～ 206，16.048～ 401.2和16.048～ 401.2 μg/mL與相應峰面積呈良好線性關系，平均加樣回收率（n=6）分別為：98.92%，98.78%，97.91%，98.00%，98.13%，98.10%，RSD分別為 0.46%，0.43%，0.26%，0.70%，0.62%，0.76%。結論：UPLC分離效果及重復性好，且快速簡便，可作為腦安顆粒的質量控制方法。

超高效液相色譜；腦安顆粒；人參皂苷；含量測定

腦安顆粒由川芎、當歸、紅花、人參與冰片5味藥組成。有活血化瘀、益氣通絡的功效，用于治療腦血栓形成急性期、恢復期氣虛血瘀[1]。臨床應用證實腦安顆粒對血管性頭痛的治療效果較好，且不良反應少[2]；對老年神經衰弱也具有顯著療效[3-4]。目前標準采用的是薄層色譜法測定人參皂苷Re[1]，操作復雜且準確度不高，而對其他人參皂苷類成分沒有規定。目前也尚未見同時測定腦安顆粒中人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3、Rd這6種成分含量的報道。由于腦安顆粒成分復雜，若采用普通液相色譜法測定6種人參皂苷耗時較長，效率低下。超高效液相色譜（UPLC）技術的發展，為復雜體系中藥的分離分析提供了良好的平臺[5]。為提高腦安顆粒質量控制標準，進一步保證藥物療效，本研究采用UPLC技術，建立了同時測定腦安顆粒中人參皂苷 Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3、Rd 6種成分的分離分析方法，此方法快捷、準確，重復性好，為腦安顆粒質量標準提供依據。

1　儀器、試劑與試藥

1.1儀器

超高效液相色譜系統（ACQUITY UPLC，美國Waters公司）；天平XS 205（METTLER TOLEDO）；色譜柱：ACQUITY BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）。

1.2試劑與試藥

乙腈為色譜純，水為超純水；人參皂苷Rg1對照品（批號：110703-201530，含量91.7%）、人參皂苷Re對照品（批號：110754-201525，含量92.3%）、人參皂苷Rb1對照品（批號：110704-201424，含量93.7%）、人參皂苷Rb2對照品（批號：110715-200802，含量94.8%）、人參皂苷Rb3對照品（批號：111686 -201002，含量 92.7%）、人參皂苷 Rd對照品（批號：111818-201001，含量94.4%），對照品均來源于中國食品藥品檢定研究院。腦安顆粒 （批號：20140610），河南省百泉制藥有限公司生產。

2　方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱為 Waters Acquity UPLC HSS T3 C18（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm）；柱溫 35℃；樣品溫度10℃；進樣體積1 μL；流速0.45 mL/min；檢測波長 203 nm；流動相 A為乙腈，流動相B為水，梯度洗脫程序見表1。在此條件下，6種人參皂苷分離度均大于1.5，對照品與樣品UPLC色譜圖見圖1。

表1　腦安顆粒中6種皂苷類成分測定的梯度洗脫程序

圖1　UPLC圖

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備取人參皂苷 Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3、Rd對照品適量，精密稱定，分別置于100 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，使其濃度分別為1.012，2.501，2.014，1.030，2.006，2.058 mg/mL，作為對照品儲備液 1～ 6。精密量取上述6個對照品溶液各1 mL，置于25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成含人參皂苷 Rg1（40.48 μg/mL）、Re（100.04 μg/mL）、Rb1（80.56 μg/mL）、Rb2（41.20 μg/mL）、Rb3（80.24 μg/mL）、Rd（82.32 μg/mL）的對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備取約4 g，精密稱定，加入甲醇 50 mL，超聲提取 40 min，放冷，濾過，濾液蒸干，加水20 mL使溶解，用二氯甲烷洗滌2次，每次20 mL，棄去二氯甲烷液，水液用水飽和正丁醇提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，用1%氫氧化鈉溶液洗滌二次，每次 20 mL，棄去堿液層，用正丁醇飽和的水洗滌 2次，每次20 mL，再將正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇使溶解，并轉移至10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3方法學考察

2.3.1線性關系考察精密量取對照品溶液0.20，0.30，0.50，1.00，2.00，3.00，5.00 μL，分別進樣，測定峰面積。分別以各色譜峰面積（Y）對其濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程，結果見表 2。

表2　6種人參皂苷的回歸方程

2.3.2精密度試驗精密吸取對照品溶液 1 μL，重復進樣5次。結果，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷 Rb1、人參皂苷 Rb2、人參皂苷 Rb3和人參皂苷Rd峰面積的RSD分別為0.52%，0.91%，0.45%，0.63%，0.52%和0.92%（n=5），表明本試驗方法的精密度良好。

2.3.3溶液穩定性試驗精密吸取同一供試品溶液 （批號：151106）1 μL，分別于0，2，8，12，24 h進樣，測定峰面積。結果，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3和人參皂苷Rd峰面積的RSD分別為0.60%，0.71%和0.93%，0.97%，0.54%和1.02%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.4重復性試驗取同一批樣品（批號：151106）適量，共5份，按“2.2.2”項下方法制備，每份測定3次。結果，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3和人參皂苷Rd的平均含量分別為每袋0.19，0.34，0.17，0.15，0.27，0.34 mg，RSD分別為1.12%，1.03%，0.80%，0.43，0.59%和0.66%，表明本法重復性良好。

2.3.5加樣回收率試驗取已知含量的樣品（批號：151106）適量，研細，精密稱取4 g，分別精密加入人參皂苷 Rg1、人參皂苷 Re、人參皂苷 Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3和人參皂苷Rd對照品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表3。

表3　加樣回收率試驗結果

2.4樣品測定的結果

取3批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，每批制備3份，每份測定2次，取兩份的平均值，見表4。

表4　樣品測定結果　（mg/袋）

3　討論

3.1人參總皂苷純化方法的選擇

腦安顆粒為多組分組成的中成藥，成分復雜，若提取不完全雜質較多，影響人參皂苷的測定。因此采用溶劑萃取法對人參皂苷進行純化，除去大部分雜質。參考文獻[6-8]，先用甲醇超聲提取，與原標準[1]中的索氏提取相比時間縮短、收率提高、溫度降低；用二氯甲烷去除大部分雜質；再用水飽和正丁醇萃取樣品中人參皂苷，最后用正丁醇飽和水去除樣品中過量的雜質。文獻[9-10]報道采用D-101大孔吸附樹脂進行純化，雖效果較好，但需對大孔樹脂進行預處理、裝柱、洗柱等步驟，方法繁瑣、耗時；而溶劑萃取法相對簡便、用時少，通過上述萃取方法可去除大部分雜質。所以，本實驗采用溶劑萃取法對人參中的人參皂苷進行分離純化。

3.2洗脫梯度的選擇

本實驗建立了同時測定腦安顆粒中6種人參皂苷含量的方法，參照文獻[11-15]報道，通過探索不同的洗脫體系，不同的梯度洗脫程序，最終得到了優化洗脫系統，使 6種重要的人參皂苷類成分獲得完全的分離。選用乙腈-水梯度洗脫，其中，0～ 9 min時，乙腈占18～ 22，在18～ 26 min之間，乙腈占52～ 18，可使樣品中人參皂苷 Rg1與人參皂苷Re、人參皂苷Rb2與人參皂苷Rb3的分離度最佳（R≥1.5），該色譜條件可用于6種人參皂苷的含量測定。用超高效液相色譜法同時測定腦安顆粒中6種人參皂苷，改進了原標準中的含量測定方法，該方法更加準確、快速、可靠，同時增加了腦安顆粒的檢測項目，可作為腦安顆粒的質量控制方法。

本實驗采用UPLC同時測定了腦安顆粒中6種人參皂苷類成分，增加了原標準對人參的檢測指標，又改進了原標準的方法，且該方法更加準確、快速、可靠。

[1]國家藥典委員會.國家食品藥品監督管理局藥品標準.新藥轉正標準第 34冊[S].國家食品藥品監督管理局，WS3-208（Z-208）-2002（Z），34-73.

[2]鞠保順.腦安顆粒治療血管性頭痛30例臨床分析[J].臨床醫學研究與實踐，2016，1（11）：23-25.

[3]吳敏，邵敏，沈志華，等.棗仁安神顆粒結合腦安顆粒治療老年神經衰弱的超聲評估觀察[J].中華中醫藥學刊，2015，33（2）：360-361.

[4]張會秋.個性化護理結合腦安顆粒治療老年神經衰弱的超聲評估觀察[J].中國醫藥指南，2016，14（7）：275.

[5]吳立蓉，王秀鳳，高衛東，等.超高效液相色譜（UPLC）在藥物分析領域中的應用[J].藥物分析雜志，2008，28（11）：1976-1981.

[6]張崇禧，鄭友蘭，張春紅，等.不同方法提取人參總皂苷工藝的優化研究[J].人參研究，2003，15（4）：5-8.

[7]張春紅，張連學，李向高，等.人參皂苷常規水提取法和新提取方法的比較研究[J].中藥材，2006，29（10）：1040-1042.

[8]信小娟，陳旸，叢建華，等.不同提取方法對人參皂苷收率的影響[J].中國林副特產，2015，135（1）：34-35.

[9]桂雙英，周亞球.比色法測定人參中人參總皂苷的含量[J].安徽中醫學院學報，2003，22（4）：51-52.

[10]蔡一新，黃宗銹，蘇必桔，等.保健食品中人參總皂苷含量的測定[J].海峽預防醫學雜志，2001，7（6）：35.

[11]孫英英，郭玉海，林華慶，等.UPLC測定丹七片中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的含量[J].中國生化藥物雜志，2005，35（1）：148-150.

[12]李慧，許亮，溫美佳，等.不同產地人參皂苷成分含量UPLC法測定及質量評價[J].中華中醫藥雜志，2015，30（6）：1963-1968.

[13]林蘇娜，余楚欽，林華慶，等.UPLC測定參麥注射液中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（8）：48-50.

[14]逄世峰，曲正義，李亞麗，等.UPLC法同時測定人參糖中 7種人參皂苷[J].特產研究，2014，（3）：53-56.

[15]吳立蓉，王秀鳳，高衛東，等.超高效液相色譜法快速測定復方丹參片中皂苷類成分的含量[J].廣東藥學院學報，2016，32（1）：32-35.

Simultaneous Determination of Contents Six Kinds of Ginsenosides in Naoan Granules by UPLC

Hu Ziyan，Sun Xiarong，Shi Da，Zhu Ying，Jiang Jian（1 Nanjing Institute for Food and Drug Control，Jiangsu Nanjing 210000，China）

Objective：To develop a ultra performance liquid chromatography（UPLC）method for simultaneous determination of contents of six kinds of ginsenosides in Naoan granules.Methods：ACQUITY BEH C18column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）was used with a mobile phase consisting of acetonitrile（A）-water（B）by gradient elution at a flow rate of 0.45 mL/min.The wavelength for detection was 203 nm while the column temperature was 35℃.Results：The contents of ginsenosides Rg1，Re，Rb1，Rb2，Rb3and Rd within the range of 8.096～ 202.4，20.008～ 500.2，16.112～ 402.8，8.24～ 206，16.048～ 401.2 and 16.048～ 401.2 μg/mL showed good linear relationship to the corresponding peak areas，respectively.The average recoveries of the six kinds of ginsenosides were 98.92%，98.78%，97.91%，98.00%，98.13%and 98.10%，with RSDs of 0.46%，0.43%，0.26%，0.70%，0.62%and 0.76%，respectively.Conclusion：The UPLC method showed good separation effect and reproducibility，which was rapid，simple，and might be used for the quality control of naoan granules.

Ultra Performance Liquid Chromatography（UPLC）；Naoan Granules；Ginsenoside；Content Determination

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.12.006

胡紫艷，女，碩士，主管藥師。研究方向：藥物分析。通訊作者E-mail：huzy0903@163.com

（2016-09-29）