RD105缺失基因檢測法在結核分枝桿菌分型中的應用※

李 斌，劉 壽，杜文琪，汪海靜，蘇效東，文國穎，梁 軍，王兆芬

(青海大學醫學院公共衛生系，810001 西寧)

?

RD105缺失基因檢測法在結核分枝桿菌分型中的應用※

李 斌，劉 壽，杜文琪，汪海靜，蘇效東，文國穎，梁 軍，王兆芬*

(青海大學醫學院公共衛生系，810001 西寧)

目的 探討RD105缺失基因檢測法在結核分枝桿菌分型中的應用。方法 133株結核分枝桿菌分別采用Spoligotyping分型法和RD105基因缺失法鑒別北京基因型。結果 133株結核分枝中114株為北京基因型，占85.7%，19株為非北京基因型，占14.3%，經RD105缺失基因檢測133株結核分枝桿菌臨床分離株中，115株為北京基因型，占86.4%，18株為非北京基因型，占13.6%，Spoligotyping基因分型法與RD105缺失基因檢測法比較差異無統計學意義(χ2=0.333，P=0.563)，RD105缺失基因檢測法的靈敏度為99.1%，特異度為89.5%，陽性預測值為98.3%，陰性預測值為94.4%。ROC曲線下面積為0.943。結論 RD105基因缺失法檢測可以替代Spoligotyping基因分型法。

結核分枝桿菌 RD105 Spoligotyping ROC曲線下面積

隨著分子生物學技術的不斷發展，結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)基因型分型技術在該病的流行病學研究中起到了重要的作用，通過對MTB的分型可以判斷出該區域流型菌株的類型、病例與病例之間的關系等。MTB中有一組具有相似遺傳特征的北京型基因(Beijing genotype)。之前有研究表明青海省流行菌株為北京基因型[1]。北京基因型菌株是一類源于共同祖先的后代菌株，自1995年有van Soolingen等首次報道以來，全球已發現該菌株的流行，在亞洲地區該菌株為主要流行菌株。近年來隨著研究深入，研究者發現在北京基因型中RD105存在缺失區域，提出了RD105可以作為北京基因型菌株的分子標志物[2]。本研究采用基于PCR法的RD105缺失檢測法和間隔區寡核苷酸分型方法(spacer oligonucleotide typing，Spoligotyping)對青海省133株結核分枝桿菌臨床分離株進行基因分型，探討RD105基因缺失檢測法在結核分枝桿菌基因分型中的運用。

1 材料與方法

1.1 菌株

133株結核分枝桿菌臨床分離株和對照標準菌株H37Rv由青海省疾病預防控制中心傳染病預防控制所結核病實驗室提供。

1.2 DNA

用生理鹽水從L-J培養基的斜面上洗脫菌體，80 ℃孵育30 min滅活，離心(12000r/min)3 min，棄上清收集菌體，用500 μL生理鹽水充分懸浮、100 ℃水浴1 h，離心(12000r/min)5 min取上清即為PCR擴增模板。-20 ℃保存備用。

1.3 主要試劑盒、儀器

2×Taq Master Mix、0.5×TBE、DNA MarkerⅡ(北京天根生物公司)，凝膠成像儀(Bio-RAD，USA)。

1.4 Spoligotyping基因分型法與RD105缺失基因檢測法

1.4.1 Spoligotyping基因分型法

DR區引物設計和反應條件及43個寡核苷酸探針設計參照參考文獻[3]，將Spoligotyping結果進行數字轉化，并通過SpolDB4.0數據庫進行比對分析確定菌株的類型。

1.4.2 RD105缺失基因檢測法

引物設計和反應條件參照文獻[4]，RD105F：CAAGGTACGGCGGCTGGGGATTC；RD105R：GCGGCGGGGTTAAACAGGGTGAT。PCR反應條件：預變性94 ℃ 1 min；變性94 ℃ 30 s；退火68 ℃ 30 s；延伸72 ℃ 285 s，26個循環；終延伸72 ℃ 10 min。取10 μLPCR擴增產物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，用DNA Marker確定其分子相對量，以標準株H37Rv作為對照。目的片段為408 bp，出現此片段為非北京基因型，未出現此片段為北京基因型。

1.5 數據分析方法

所得資料采用Stata10.0軟件進行分析，兩種方法比較采用配對χ2檢驗，分別計算靈敏度(sensitivity)、特異度(specificity)、預測值(predictive value)、ROC曲線下面積(the area under the ROC curve)，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Spoligotyping基因分型法結果

用Spoligotyping基因分型法，通過SpolDB4.0數據庫比對分析。H37Rv雜交結果為20、21，33～36位點陰性，其余位點均為陽性。1～34位點陰性，35～43陽性者為典型北京家族基因型(Beijing genotype)，35～43位點間或缺失，但陽性位點至少有4個為北京基因型(Beijing-like)或非典型北京家族基因型。以上兩種基因型統稱為北京家族基因型。133株結核分枝中114株為北京基因型，占85.7%，19株為非北京基因型，占14.3%。結果見圖1。

圖1 部分Spoligotyping基因分型結果

Figure 1 The partial results of genotypic identification with Spoligotyping test

2.2 RD105缺失基因檢測法結果

用RD105缺失基因法，檢測133株結核分枝桿菌臨床分離株，115株為北京基因型，占86.4%，18株為非北京基因型，占13.6%。結果見圖2。

圖2 RD105檢測結果

Figure 2 The result of RD105 deletion test

2.3 RD105缺失基因檢測北京型菌株的評價效果

Spoligotyping基因分型法是檢測北京型基因的金標準[5]，故采用此方法來評價RD105缺失基因檢測法。兩種方法比較差異無統計學意義(χ2=0.333，P=0.563)。RD105缺失基因檢測法的靈敏度為99.1%，特異度為89.5%，陽性預測值為98.3%，陰性預測值為94.4%。ROC曲線下面積為0.943。結果見表1。

表1 Evaluation of Beijing type strain

3 討論

傳統的流行病學方法只能從疾病的“三間分布”了解情況，不能很好地揭示結核病的傳播規律。分子生物學DNA指紋技術，與傳統的傳染病流行病學研究相結合，可以確定傳染病的起源、傳播、分布、消長和流行規律[6]。傳統的分型技術包括藥敏分型、生物化學多樣性等方法，但這些方法存在諸多缺陷。隨著研究者們在結核分子流行病研究技術上的不斷深入，分子分型技術現今成為結核病流行病學的主要研究方法之一。現代分子生物學技術以其簡便、快捷、敏感性好和特異性高而廣泛應用。其中IS6110-限制性片段長度多態性分析(restriction fragment length polymorphism，IS6110-RFLP)、多位點可變數量串聯重復序列分析(multiple loci VNTR analysis，MLVA)及Spoligotyping分析等已成為結核菌株分型的重要方法。

IS6110-RFLP是國際一致公認的DNA分型方法的“金標準”，但IS6110-RFLP分型方法需要提取結核菌大量的DNA，獲得結果的時間長，且結果的重復性和比較性較差，對于IS6110拷貝小于5個或無拷貝結核菌株分辨能力差，需要一些特殊的軟件分析結果，影響了該方法的推廣。

可變數目串聯重復序列(variable-number tandem repeat，VNTR)存在高度多態性，DNA片段高度重復。因此將多個VNTR位點聯合起來可提高鑒別能力，即MLVA，其基因分型方法的辨識能力幾乎等同于以IS6110為基礎的基因分型，但該技術簡便快速，可操作性強。不但彌補了IS6110-RFLP基因分型技術在低拷貝菌株分型中的不足，而且它一般不需用高度純化的DNA，可直接使用結核分枝桿菌的培養物。且結果是數字化的，易于建立數據庫，便于與其他菌株間的比較。但與Spoligotyping分型方法比較顯得工作過于繁重。

Spoligotyping基本原理是基于直接重復區(direct repeat，DR)的多態性，DR區只出現于結核分枝桿菌復合群中，由若干個保守的長為36 bp的直接重復序列組成，并被間隔區分開，每個間隔區序列長為35～41 bp，不同的MTB菌株在43個間隔區存在不同的序列，由此可對MTB進行鑒別。該方法是一種獨特的以PCR為基礎的分子分型方法，其操作簡便、結果易于數字處理、可重復性高、分型效果穩定并且具有較豐富的多態性，在世界范圍內得到廣泛的應用。

而近些年通過比較基因組學的一些方法發現結核菌的基因上存在片段缺失，這些容易發生缺失的片段稱為Large sequence polymorphism或Regions of Difference，簡稱LSP或RD。有學者以RD為分類靶標研究全球范圍收集的結核分枝桿菌，發現全球結核分枝桿菌的流行具有明顯地域性，并據此將結核分枝桿菌分為6個具有進化關系的分化支：印度-大洋洲系(Indo-Oceanic)，東亞系(East Asian)、東非-印度系(East African-Indian)、歐美系(Euro-American)、西非-1系(West African 1)和西非-2系(West African 2)[7]。該方法基于PCR實驗技術，且單次的實驗方法在技術、人力、物力和財力等方面要遠遠低于Spoligotyping分型方法。

RD105基因缺失存在于北京基因型，在非北京基因型非常罕見[2]。RD105基因缺失檢測方法基于PCR技術，實驗方法簡便，易操作，對于結果不需要特殊的軟件進行分析，易于實施。本研究采用該技術對于133株結核分枝桿菌臨床分離株進行分型，結果115株(86.4%)為北京基因型，18株(13.6%)為非北京基因型。而采用Spoligotyping分型方法進行菌株分型，133株結核分枝中114株為北京基因型，占85.7%，19株為非北京基因型，占14.3%。

王娟[8]等人通過比較兩種方法得到二者的Kappa值為0.8，提示RD105不能完全替代Spoligotyping。但是本研究通過Spoligotyping基因分型法評價RD105基因缺失法檢測，靈敏度為99.1%，特異度為89.5%，陽性預測值為98.3%，陰性預測值為94.4%。ROC曲線下面積為0.943，兩種檢測方法比較差異沒有統計學意義(χ2=0.333，P=0.563)，說明RD105基因缺失法檢測可以替代Spoligotyping基因分型。這與劉敬華[9]等人研究結果一致，RD105與Spoligotyping檢測結果符合率達100.0%，Kappa值為1.0。

診斷實驗是一種評價診斷方法準確性和重要性的研究方法。其目的是通過“金標準”去評價待檢測方法的準確性。在診斷實驗中靈敏度和特異度能很好反映診斷實驗的準確性，這兩個指標越接近100.0%，顯示準確性越高。而預測值同樣也是評價診斷實驗準確性的指標，該指標受到靈敏度和特異度的影響，會隨著靈敏度和特異度的升高或降低而發生改變。ROC曲線綜合反映診斷實驗對待評價實驗方法診斷價值。并且ROC曲線兼顧了靈敏度和特異度，通過對ROC曲線下的面積大小來判斷診斷實驗的優良性。ROC曲線下面積接近1，診斷實驗效果越好。反之，接近0.5，診斷效果越差。而本研究所得結果顯示，靈敏度和特異度均接近100.0%，預測值也在90.0%以上，ROC曲線下面積也接近1，說明RD105基因缺失檢測法對MTB進行北京基因型和非北京基因型鑒別效果良好，存在誤差較小。

綜上所述，RD105基因缺失法與Spoligotyping基因分型法比較存在簡便易行，讀取結果方便，不需要借助其他軟件進行分析的優點，比Spoligotyping基因分型法更加可行。因此，RD105基因缺失法可以替代Spoligotyping基因分型法。

[1]李斌，劉海燦，王兆芬，等.青海省結核分枝桿菌臨床分離株可變數目串聯重復序列基因多態性研究[J].中華流行病學雜志，2015，36(10)：1158-1161.

[2]劉桂艷，張煒煜，王博，等.RD105基因缺失法鑒定95株結核分枝桿菌北京基因型及其耐藥相關性分析[J].中國衛生工程學.2012，11(5)：363-365.

[3]王兆芬，李斌，馬永成，等.青海省結核分枝桿菌的間隔寡核苷酸分型研究[J].中華預防醫學雜志，2015，49(6)：565-567.

[4]李斌，文飛，劉壽，等.RD105缺失基因檢測法用于青海省北京/W系結核分枝桿菌鑒定[J].廣州醫藥，2015，46(5)：11-14.

[5]Dong H，Shi L，Zhao X，et al.Genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis isolates from Tibetans in Tibet，China[J].PLoS One，2012，7(3)：e33904.

[6]文建強，田衛花，劉志廣，等.結核分枝桿菌臨床分離株MLVA法分型分析[J].中國公共衛生，2012，28(8)：1081-1083.

[7]Gagneux S，DeRiemer K，Van T，et al.Variable host-pathogen compatibility in Mycobacterium tuberculosis.ProcNatlAcadSci USA[J].2006，103(5)：2869-2873.

[8]Wang J，Liu Y，Zhang CL，et al.Genotypes and characteristics of clustering and drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosis isolates collected in Heilongjiang Province，China[J].Journal of clinical microbiology，2011，49(4)：1354-1362.

[9]Liu JH，Liu Y，Zhang CL，et al.Genotypes and characteristics of clustering and drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosis isolates collected in Heilongjiang Province，China[J].Journal of clinical microbiology，2013，49(3)：1356-1362.

Identification of the Mycobacterium tuberculosis detected by RD105 deletion test※

Li Bin，Liu Shou，Du Wenqi，Wang Haijing，SuXiaodong，Wen Guoying，Liang Jun，Wang Zhaofeng※

(Dept.Of Public Health，Qinghai University Medical College，Xining，Qinghai 810001)

Objective To identify theMycobacteriumtuberculosisdetected by RD105 deletion test.Methods 133 strains of M.tuberculosiswere identified with Spoligotyping testand RD105 deletion test respectively to classify the Beijing genotype.Results Of the 133 clinical isolates ofM.Tuberculosis，114 strains(85.7%)were belonged to the Beijing genotype，and 19strains(14.3%)were belonged to the non-Beijing genotype identified by the Spoligotyping test.While 115 strains(86.4%)were belonged to the Beijing genotype and 18strains(13.6%)were belonged to the non-Beijing genotype identified by the RD105 deletion test.There were no significant differences between the two kinds of test(χ2=0.333，P=0.563).The sensitivity，specificity，positive predictive value，negative predictive value and ROC curve area of the RD105 deletion test were 99.1%，89.5%，98.3%，94.4%，0.943，respectively.Conclusions RD105 deletion testcan replace the Spoligotyping test.

MycobacteriumtuberculosisRD105 deletion test Spoligotyping test the area under the ROC curve

※：國家自然科學基金(81160356)；青海省科技廳自然科學基金(2014-ZJ-910)；青海大學醫學院中青年科研基金(2013-KY-02)；*：通訊作者，E-mail：kristy@126.com 李 斌(1983～)男，蒙古族，河北籍，講師，碩士

R735.2

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.03.007

2015-12-12