重組hIL-10對AA大鼠T淋巴細胞及IL-17A的影響研究①

杜聯峰 孫萬邦 丁立珉 唐艷麗

(遵義醫學院珠海校區/貴州省免疫學研究生教育創新基地，珠海519041)

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重組hIL-10對AA大鼠T淋巴細胞及IL-17A的影響研究①

杜聯峰 孫萬邦②丁立珉 唐艷麗

(遵義醫學院珠海校區/貴州省免疫學研究生教育創新基地，珠海519041)

目的：以重組人白細胞介素-10(human interleukin-10，hIL-10)及其聯合甲氨碟呤(MTX)作用佐劑性關節炎大鼠模型，檢測T淋巴細胞亞群及IL-17A水平的變化情況，研究重組hIL-10及其聯合MTX治療佐劑性關節炎大鼠的效果。方法：用IL-10、MTX以及IL-10+MTX處理AA大鼠模型，用流式細胞儀測定各組大鼠血液中CD4+T細胞與CD8+T細胞比值，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測大鼠血清IL-17A的含量。結果：各治療組CD4+淋巴細胞總數與CD4+/CD8+值不同程度下降，各治療組與模型組比較有顯著性差異(P<0.05)。各治療組IL-17A水平有不同程度下降，各治療組與模型組比較有顯著性差異(P<0.05)，聯合組與IL-10組比較有顯著性差異(P<0.05)。結論：重組hIL-10能下調AA大鼠血液中CD4+T細胞的數量及CD4+/CD8+比值，降低血清中IL-17A水平，聯合組較IL-10組對血清中IL-17A影響更顯著，提示重組hIL-10聯合MTX 在治療類風濕關節炎中能更好地發揮作用。

重組人白介素-10；佐劑性關節炎；T細胞亞群；IL-17A

類風濕關節炎(Rhematic arthritis，RA)是以慢性進行性關節滑膜以及關節軟骨損傷為特征的一種自身免疫性疾病，發病率高[1]。近年研究證實RA發生與免疫調節紊亂有關，T細胞的異常活化及T細胞亞群的平衡失衡與RA的發病密切相關，另外，Th17細胞所分泌的IL-17A在類風濕性關節炎患者中明顯升高，并參與了骨關節的損害，是RA發病重要環節之一[2]。IL-10是一種主要由Th2細胞、巨噬細胞等分泌的一種重要免疫抑制性的因子，在人體內主要是由巨噬細胞產生，IL-10被認為是介導下調炎癥級聯反應中的重要細胞因子，因為它能夠抑制活化及效應性T細胞、巨噬細胞和單核細胞的功能，介導免疫抑制的作用[3,4]。研究表明IL-10在RA中主要由關節部位巨噬細胞和T細胞產生，其可通過抑制炎性細胞因子的分泌，減輕關節的腫脹和炎性細胞浸潤及炎性滲出物的產生，具有明顯的免疫抑制和免疫調節功能，有一定的治療類風濕性關節炎的前景。甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)作為一種慢作用抗風濕藥，臨床上已普遍用于治療類風濕關節炎，它主要是通過其細胞內代謝產物多聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTXPG)持續發揮治療作用[5]。本研究通過應用重組hIL-10及其聯合甲氨碟呤(MTX)作用佐劑性關節炎大鼠模型，檢測血液T淋巴細胞亞群及血清中IL-17水平的變化情況，進一步通過動物實驗證實IL-10在RA中的作用，為重組hIL-10在類風濕關節炎的應用提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康SPF級SD大鼠40只，雌性，由廣東省實驗大鼠中心提供，[許可證號SCXK(粵)2008-0002]。在遵義醫學院珠海校區動物實驗中心飼養。

1.1.2 主要試劑與實驗儀器 anti-rat CD8a PE OX8、anti-rat CD4 FITC OX3購自美國Sigma公司，Rat IL-17A ELISA Kit購自欣博盛生物科技有限公司，流式細胞儀，酶標儀等。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及動物模型的建立 40只SD大鼠編號以后按隨機數字表法分為2組：空白對照組8只SD大鼠，AA大鼠模型組32只SD大鼠，AA大鼠模型組造模：將卡介苗于80℃滅活后加入弗氏不完全佐劑中充分乳化混勻配成10 mg/ml的弗氏完全佐劑，于左側足底皮下注射0.1 ml建立AA模型。20 d后同法加強免疫1次，加強免疫后15 d后造模成功，隨機分為4組，即模型對照組、IL-10治療組、MTX治療組、IL-10與MTX聯合治療組，每組8只。三個治療組自造模成功日起通過腹腔給藥15 d。給藥劑量分別為空白對照組NS 1 ml/kg；IL-10組5 μg/ml；MTX組1 mg/kg；聯合組3 μg/kg IL-10+1 mg/kg MTX。

1.2.2 AA大鼠模型構建成功一般情況觀測 造模后，觀察各組大鼠的精神狀態、食量、活動、毛色變化、體溫等情況。通過血細胞分析儀檢測大鼠外周血液白細胞數量的變化。

1.2.3 T細胞亞群檢測 末次給藥后，取大鼠外周血50～100 μl于EDTA抗凝管中，每管分別加入抗大鼠FITC-CD4抗體，PE-CD8抗體各10 μl，室溫下振蕩混勻，避光放置30 min，每管加入溶血素2 ml，裂解紅細胞10 min，1 000 r/min離心10 min，棄上清：每管再加入PBS液2 ml洗滌細胞，500 r/min離心5 min，棄上清，加入多聚甲醛10滴重懸細胞，上流式細胞儀進行檢測。

1.2.4 血清IL-17A檢測 各組末次給藥后通過內眥采血2 ml，分離血清，ELISA法檢測血清中細胞因子IL-17A水平。

2 結果

2.1AA模型大鼠構建成功 大鼠行為學改變：模型組大鼠于注射弗氏完全佐劑后開始出現不同程度食欲下降，皮毛聳立、足關節腫脹，造模后第2天注射局部出現紅腫，皮溫升高(圖1)。造模后大鼠出現體重減輕、進食量減少、跛行、活動減少等癥狀。對照組未出現上述表現。

血液中白細胞數量變化情況：模型組大鼠外周血白細胞總數與正常對照組比較明顯升高(表1)，有顯著差異(P<0.05 )。

2.2 實驗大鼠T細胞亞群測量結果 與空白對照組相比，模型組的大鼠外周血中CD4+T淋巴細胞的百分比含量明顯升高，兩組之間有顯著性差異(P<0.01)，CD8+T淋巴細胞的百分比無明顯變化，兩組之間無顯著性差異(P>0.05)，模型組CD4+/CD8+T淋巴細胞比值升高，兩組之間有顯著性差異(P<0.05)。各治療組與模型組相比CD4+T淋巴細胞數均有不同程度降低(P<0.05)，其中聯合組與IL-10組、MTX組比較有顯著差異(P<0.05 )，說明聯合用藥組對CD4+T淋巴細胞的調節作用比單用IL-10或MTX要好。CD8+T淋巴細胞計數顯示各治療組與模型組和空白對照組比較，CD8+T淋巴細胞數均有不同程度升高(P<0.05)，但各治療組調節CD8+T淋巴細胞水平無統計學差異(P>0.05)，各治療組與模型組比較，CD4+/CD8+T淋巴細胞比值降低，說明各治療組能下調CD4+/CD8+細胞比值，治療組能調節T細胞亞群的平衡，見表2。

圖1 模型組大鼠足關節紅腫Fig.1 Model group rat paw joint swelling

表1 各組大鼠外周血白細胞數量的變化(WBC×109L-1)

Tab.1 Levels of leukocytes in peripheral blood of rates(WBC×109L-1)

GroupsBefcremodelingAftermodeling20dAftermodeling35dNormal6.39±0.816.18±1.326.26±0.75Model6.58±1.4521.7±2.311)20.16±2.071)

Note：Compared with normal group,1)P<0.05.

GroupsCD4+CD8+CD4+/CD8+Normal31.46±2.951)20.39±2.951.11±0.391)Model41.75±4.5420.27±1.692.05±0.06hIL-1037.80±0.251)23.02±1.141)1.61±0.061)MTX36.74±0.541)22.21±1.131)1.63±0.041)Joint35.01±1.101)2)3)22.06±0.891)2)1.56±0.151)

Note：Compared with model group,1)P<0.05；compared with IL-10 group,2)P<0.05；compared with MTX,3)P<0.05.

GroupsIL-17A(ng/L)Normal111.04±11.151)Model258.41±15.15IL-10186.24±13.411)MTX128.61±13.571)2)Joint112.31±15.091)2)

Note：Compared with model group,1)P<0.05 ；compared with IL-10 group,2)P<0.05.

2.3 IL-17A動態檢測結果 模型組的AA大鼠血清中IL-17A水平顯著高于空白對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，各治療組與模型組相比血清中IL-17A有不同程度降低，差異有統計學意義(P<0.05)，其中MTX組、聯合組與IL-10組比較有顯著差異(P<0.05 )，說明MTX和聯合用藥組的效果要比單用IL-10好，但是聯合用藥組與MTX組比較，IL-17A水平下降最多，說明聯合用藥較單用MTX更有效。見表3。

3 討論

RA通常是由于機體對自身抗原外周免疫耐受失衡導致自身反應性效應細胞異常擴增而引發的組織特異性炎癥反應。在RA的發病機制中T細胞的作用被認為是有非常重要作用的。在RA發病過程中CD4+Th1細胞的活化被認為是炎性效應細胞誘發關節炎癥反應的重要因素。在機體正常狀態下，CD4+/CD8+T淋巴細胞比例維持在一個動態平衡的狀態，是機體免疫功能的一項重要指標[6]，近年來研究表明在類風濕性關節炎患者體內CD4+/CD8+T淋巴細胞比例失衡。最近研究在 RA患者中自身IgG抗體反應的特異靶點[7,8]，通過分析表明：這些特異靶點能夠與自身HLA結合，從而誘發自身反應性CD4+T細胞異常激活和擴增，導致關節局部滑膜細胞，成纖維細胞，單核細胞的聚集和上調黏附分子的表達并進一步促進促炎細胞因子和趨化因子的分泌，包括IL-1、IL-6、IL-8、MIP-I等[9]。這些細胞因子直接參與骨關節炎癥反應，加重骨關節的炎癥病理損傷。本實驗結果顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠外周血CD4+T細胞含量明顯升高，CD8+T細胞含量無明顯變化，CD4+/CD8+T淋巴細胞比值升高。經過治療后，各治療組與模型組相比，CD4+T淋巴細胞數均有不同程度降低，CD8+T淋巴細胞數均有不同程度升高，CD4+/CD8+T淋巴細胞比值降低。這些結果表明在佐劑性關節炎大鼠體內存在T細胞免疫功能失調，自身反應性CD4+T細胞異常活化和擴增，導致CD4+T淋巴細胞數升高，從而導致骨關節炎癥的發生和發展。本研究結果表明，與模型組比較通過重組IL-10、MTX及其IL-10+MTX聯合治療后，CD4+T淋巴細胞數量下降，CD4+/CD8+T淋巴細胞比值降低，這些結果說明IL-10可以抑制活化及效應性CD4+T細胞功能，介導免疫抑制的作用，從而減輕骨關節的炎癥反應和損傷，IL-10和MTX聯合應用與單用MTX對CD4+T細胞數及CD4+/CD8+T細胞比例無顯著性差異。本研究在AA大鼠模型治療15天后，IL-10組和MTX組及其聯合用藥組的關節病變與模型組相比較，病變程度有所減輕，足關節軟組織腫脹度明顯降低，以聯合用藥組的效果最明顯，大鼠活動能力明顯增強，說明IL-10可以增強MTX對類風濕性關節炎的治療效果。

IL-17A是由Th17細胞產生的促炎性細胞因子，IL-17家族包括六個成員(A-F)，各個細胞因子間大約有20%～30%的相同序列[10]，研究發現IL-17A在類風濕性關節炎患者滑膜中表現出與疾病嚴重程度相關的細胞因子，在患者體內發揮多種生物學活性，參與炎癥及骨關節滑膜細胞的損傷，在RA的病理過程中扮演著重要的角色[11]。研究表明類風濕性關節炎動物模型中抑制IL-17A的作用可以明顯抑制關節炎癥狀，減輕局部炎癥反應的發生，主要因為IL-17A可以刺激類風濕性關節炎關節滑膜細胞中IL-6和IL-8的表達[12]，上調軟骨細胞及滑膜成纖維細胞金屬蛋白酶的表達，從而參與骨及軟骨的破壞、血管新生促進軟骨蛋白多糖及膠原降解，抑制軟骨細胞蛋白的合成[13]。本實驗通過檢測IL-17A水平，模型組的AA大鼠血清中IL-17A水平顯著高于空白對照組，各治療組與模型組相比血清中IL-17有不同程度降低，這些結果說明IL-10可以抑制AA大鼠體內Th17細胞功能，減少IL-17A的釋放，從而減輕骨關節的炎癥反應和損傷，IL-10與MTX聯合應用與單用IL-10治療對IL17A水平的影響有顯著性差異，治療可以取得更好的效果。

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[收稿2015-08-01]

(編輯 許四平)

Effect of recombinant hIL-10 on lymphocytes and IL-17A of an AA rat model

DU Lian-Feng，SUN Wan-Bang，DING Li-Min，TANG Yan-Li.Zhuhai Campus Zunyi Medical College/Graduate Education and Innovation Base of Immunology in Guizhou Province，Zhuhai 519041，China

Objective:Adjuvant arthritis(AA)rats interfered with recombinant hIL-10,methotrexate(MTX)separately,we detected the changes of T cell subsets in rat′s blood and IL-17 A in rat′s serum.Methods: AA rats interfered with recombinant hIL-10,MTX and IL-10 plus MTX.The changes of the CD4+and CD8+T cell subsets were detected by flow cytometry;the Levels of IL-17A in serum of rats were measured by ELISA method. Results: Compare to normal control group,the CD4+T cell total quantity and CD4+/CD8+T cell Proportion was significantly decreased,there were significant differences between the treatment group and the untreated group(P<0.05),the IL-17A of treatment group was significantly decreased,there was a significant differences(P<0.05).The combination group had significant difference compared with IL-10 group.Conclusion: Recombinant hIL-10 can down-regulate the blood of AA rats in the number of CD4+T cells and CD4+/CD8+ratio,reduce serum levels of IL-17A.The combination group compared with the IL-10 group effect on serum IL-17A more significantly,the results displayed recombinant hIL-10 plus MTX in the treatment of rheumatoid arthritis can better play the role.

Recombinant hIL-10；Adjuvant arthritis；T cell subsets ；Interleukin-17A

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.005

①本文受貴州省教育廳自然科學重點培育項目(2008032)資助。

杜聯峰(1976年-)，男，碩士，副教授，主要從事分子免疫學研究，E-mail：8wy149842@163.com。

R392.12

A

1000-484X(2016)04-0476-04

②通訊作者，E-mail：sunwb7224@sina.com。