轉錄因子Foxp3對人肺腺癌細胞A549增殖周期的影響及機制研究

劉亞慶 趙 博 羅亞東 李祎南 楊 巍

(吉林大學基礎醫學院免疫學系,長春130021)

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轉錄因子Foxp3對人肺腺癌細胞A549增殖周期的影響及機制研究

劉亞慶 趙 博 羅亞東 李祎南 楊 巍

(吉林大學基礎醫學院免疫學系,長春130021)

目的：研究Foxp3對肺腺癌細胞A549增殖及細胞周期的影響，并探討相關調控機制。方法：采用siRNA沉默A549細胞Foxp3表達；MTT法檢測細胞增殖；流式細胞術檢測細胞周期變化；RT-PCR篩選細胞周期相關checkpoint基因；免疫熒光及雙熒光素酶報告基因分析Foxp3對相關checkpoint基因調控機制。結果：沉默A549細胞Foxp3后，其增殖明顯減慢并發生G0/G1期阻滯，G1/S期checkpoint基因CCND1表達顯著降低。機制研究發現Foxp3能直接調控CCND1表達。結論：Foxp3通過上調細胞周期G1/S期checkpoint基因CCND1表達，促進肺腺癌細胞A549增殖，從而促進了肺腺癌發展，為肺腺癌的發生發展及治療靶點提供了新思路。

Foxp3；CCND1；肺腺癌；增殖；細胞周期

Foxp3(Forkhead box protein 3)是叉頭/翼狀螺旋轉錄因子家族成員之一，最初被發現表達于CD4+CD25+調節性T淋巴細胞(regulatory T cells,Tregs)，是其特異的標志物，也是維持其免疫抑制功能的關鍵調節基因。在某些腫瘤中，如結腸癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌等，外周血和腫瘤局部Foxp3+Tregs增多，能抑制多種免疫細胞的作用，促進腫瘤免疫逃逸[1]，與腫瘤進展及不良預后關系密切[2]。而近年研究發現Foxp3不僅在Tregs表達，在多種腫瘤組織和腫瘤細胞中也有表達，但是發揮的作用、與預后的關系卻不盡相同。在舌鱗狀細胞癌、肝癌、胃癌中，Foxp3表達與不良預后呈正相關，發揮促癌作用[3,4]；而在前列腺癌、乳腺癌中，Foxp3高表達者預后較好，Foxp3發揮抑癌作用[5,6]。惡性腫瘤的發生發展是多基因參與的過程，表現為細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為調節異常，這是影響患者預后的重要因素。因此，腫瘤細胞Foxp3可能改變了腫瘤細胞的生物學行為，進而促進或抑制腫瘤的發生發展，影響患者預后。增殖是細胞的重要生命特征，在胃癌、黑色素瘤中，Foxp3對腫瘤細胞增殖的影響也不一致[7,8]。腫瘤細胞能夠無限增殖究其原因在于細胞周期調控紊亂，細胞周期的調控是一個精細復雜的過程，由多種蛋白共同參與。在肺腺癌中，Foxp3對其增殖影響尚不明確，其機制研究更是鮮有報道。因此，本課題擬以人肺腺癌細胞A549為模型，研究Foxp3對肺腺癌細胞增殖周期的影響及相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑 人肺腺癌細胞系A549為本課題組前期凍存。Foxp3 siRNA購于廣州銳博公司。轉染試劑Lipofecta mine 2000購于Invitrogen公司。MTT購于Sigma公司。細胞周期試劑盒、anti-Foxp3和anti-CCND1購于天津三箭公司。膠回收試劑盒和DNA抽提試劑盒購于Roche公司。pGL3螢光素酶雙報告載體質粒以及雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于Promega公司。限制性內切酶KpnⅠ、BgⅢ及T4 DNA連接酶購于北京全式金公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA沉默肺腺癌細胞Foxp3表達 取對數生長期的A549細胞，調濃度2×105ml-1，接種于六孔板(每孔1.5 ml)，次日細胞密度達到60%～70%后進行轉染。先分別孵育轉染試劑和siRNA，再將兩者充分混合，室溫孵育20 min。吸棄原六孔板內培養基，換無血清無抗生素DMEM。將上述混合溶液加入六孔板內(siRNA終濃度50 nmol/L)，置于細胞培養箱孵育6 h后，吸棄培養上清，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基繼續培養。48 h后收細胞提取總RNA，RT-PCR檢測Foxp3 mRNA表達水平。

1.2.2 MTT比色法檢測細胞增殖 取對數生長期A549細胞，調濃度8×104ml-1，接種于96孔板(每孔100 μl)。沉默Foxp3表達72 h后每孔加入10 μl MTT溶液，繼續培養4 h，棄掉上清后加入100 μl DMSO，低速震蕩10 min，使顆粒物充分溶解，于酶標儀波長570 nm測OD值。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞周期 沉默A549細胞Foxp3表達48 h后，胰酶消化收取細胞，調濃度1×106ml-1，70%乙醇4℃固定過夜。PBS洗滌2次后加入500 μl PI染液，室溫避光孵育30 min后上機檢測。

1.2.4 RT-PCR檢測細胞周期相關基因的mRNA水平 沉默A549細胞Foxp3表達48 h后，胰酶消化收取細胞，提取總RNA，RT-PCR檢測CCND1、CCND2、CCND3、CCNE2、CCDE1、CDK2、CDK4、CDK6 mRNA表達水平。

1.2.5 免疫熒光 在24孔板中做細胞爬片，次日取出玻片用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS再清洗3次，0.5% Triton室溫打孔20 min，PBS清洗后用1% BSA封閉。加入稀釋的一抗，濕盒內4℃過夜。次日加熒光二抗，PBST浸洗3次，濕盒中37℃孵育1 h，再用PBST浸洗3次。滴加DAPI避光孵育1～3 min染核，PBST洗去多余DAPI并吸干液體，封片后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因 根據http://www.geneco-poeia.com網站提供預測的CCND1可能的啟動子作用區，設計引物，為了報告載體構建簡便，在引物上下游分別插入限制性內切酶KpnI及BglII，引物由上海生工生物公司合成。上游引物為5′-GCGGTACCTCAGTCCCAGGGCAAATTCT-3′，下游引物為5′-GGCAGATCTAAACTCCCCTGTAGTCCGT-GC-3′，序列大小為1 143 bp。切膠回收PCR產物，在T4 DNA連接酶的作用下行連接反應(16℃過夜)，將連接產物轉化感受態大腸桿菌，篩選培養陽性克隆質粒測序鑒定。

沉默A549細胞Foxp3表達24 h后，轉染pGL3-CCND1-promoter質粒。48 h后收集細胞裂解物，用雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒檢測pGL3-CCND1-promoter質粒的螢光素酶活性。

2 結果

2.1 沉默A549細胞Foxp3表達 為干預A549細胞Foxp3表達，采用RNAi的方法將siRNANC、Foxp3siRNA1和Foxp3siRNA2分別轉染A549細胞48h后，RT-PCR法檢測各組細胞Foxp3表達。結果顯示：siRNA1、siRNA2兩組Foxp3表達水平明顯低于siRNANC組，差異具有統計學意義(P<0.05)。該結果表明:兩對siRNA均可特異性干擾Foxp3表達，可以用于后續實驗，見圖1。

圖1 RT-PCR mRNA水平檢測Foxp3沉默效果Fig.1 mRNA expression of silencing Foxp3 was detected by RT-PCRNote: *.P<0.05，compared with siRNA NC group.

2.2Foxp3對A549細胞增殖的影響 為研究Foxp3對A549細胞增殖的影響，沉默Foxp3后采用MTT法檢測細胞增殖情況。結果顯示：沉默A549細胞Foxp3后，細胞增殖明顯減慢，siRNA1、siRNA2兩組OD值分別為2.155±0.007、1.786±0.032，明顯低于siRNANC組，差異具有統計學意義(P<0.05)。該結果表明：Foxp3可以促進A549細胞增殖，見表1、圖2。

2.3Foxp3對A549細胞周期的影響 為研究Foxp3對A549細胞周期的影響，沉默Foxp3后采用流式細胞術檢測A549細胞的細胞周期。結果顯示：沉默A549細胞Foxp3后，細胞發生G0/G1期阻滯，siRNA1、siRNA2兩組G0/G1期細胞比例分別為65.6%、64.6%，明顯高于siRNANC組50.5%，且S期細胞比例明顯低于siRNANC組，差異均具有統計學意義(P<0.05)。該結果表明：Foxp3可以促進A549細胞從G1期向S期轉化，見圖3。

2.4Foxp3對CCND1表達的調控 為研究Foxp3調控CCND1表達過程中的作用機制，首先采用細胞免疫熒光檢測A549細胞Foxp3和CCND1的定位情況。結果顯示：在A549細胞中，部分區域出現了綠色熒光(代表CCND1表達)及紅色熒光(代表Foxp3表達)的重疊區域(黃色區域)，即CCND1與Foxp3的表達出現了共定位。該結果提示Foxp3與CCND1可能直接相互作用，見圖4。

GroupsOD570nmsiRNANC2.484±0.104siRNA12.155±0.007siRNA21.786±0.032

圖2 MTT檢測沉默Foxp3后A549增殖變化Fig.2 Proliferation of A549 after silencing Foxp3 was detected by MTTNote: *.P<0.05，compared with siRNA NC group.

2.5 G1/S期checkpoint基因的篩選 為研究Foxp3對A549細胞G1/S期checkpoint基因的影響，沉默Foxp3后采用RT-PCR檢測G1/S期checkpoint基因，包括CCND1、CCND2、CCND3、CCNE2、CCDE1、CDK2、CDK4、CDK6。結果顯示：沉默A549細胞Foxp3后，CCND1表達隨之降低，明顯低于siRNA NC組，差異具有統計學意義(P<0.05)。該結果表明，Foxp3可以促進A549細胞G1/S期checkpoint基因CCND1表達，見圖5。

為進一步驗證Foxp3是否對CCND1具有直接調控作用，我們構建了含有CCND1啟動子熒光素酶報告基因質粒(pGL3-CCND1-promoter)。重組質粒經雙酶切可見大小為1 143 bp的條帶，見圖6。熒光素酶報告基因檢測結果顯示：沉默A549細胞Foxp3后，CCND1啟動子熒光素酶報告基因活性明顯降低(P<0.05)。該結果明確了Foxp3對CCND1的直接調控作用，見圖7。

圖3 流式細胞術檢測沉默Foxp3后A549細胞周期變化Fig.3 Cell cycle of A549 after silencing Foxp3 was detected by FCMNote: *.P<0.05，compared with siRNA NC group.

圖4 A549細胞Foxp3和CCND1的定位表達Fig.4 Expression of CCND1 and Foxp3 on A549 cell by immunofluorescences

圖5 RT-PCR檢測G1/S期checkpoint基因變化Fig.5 mRNA expression of G1/S cycle checkpoint gene was detected by RT-PCRNote: *.P<0.05，compared with siRNA NC group.

圖6 雙酶切鑒定pGL3-CCND1-promoter質粒Fig.6 Identification of eukaryotic expression plasmids by restriction endonuclease analysisNote: M.Represents marker;1.Represents pGL3-CCND1-promoter;2.Represents pGL3-CCND1-promoter PCR product after digestion.

圖7 雙熒光素酶報告基因檢測Foxp3對CCND1啟動子活性的影響Fig.7 Effect of Foxp3 on activity of CCND1 promoters was detected by dual-luciferase reporter gene assayNote: *.P<0.05，compared with siRNA NC group.

3 討論

轉錄因子Foxp3是Tregs特異的標志物及細胞發育和功能的關鍵調節基因[9]。一旦Tregs缺失Foxp3，其抑制功能將隨之缺失，因此，Foxp3是維持Tregs抑制功能所必需[10]。在腫瘤微環境中，Tregs也發揮著免疫抑制作用，參與了腫瘤免疫逃逸[11,12]，去除Tregs可以誘導抗腫瘤免疫，因此，Tregs是介導腫瘤免疫逃逸的關鍵細胞。最初人們認為Foxp3僅表達于淋巴細胞，而近年來越來越多的研究發現Foxp3在多種腫瘤組織及細胞中也有表達，高表達Foxp3的腫瘤病人一般預后較差[13,14]。但Foxp3在不同腫瘤中發揮的作用也不盡相同，并且相關機制研究較少。本課題組前期研究發現Foxp3在人非小細胞肺腺癌中高表達，并與淋巴結轉移和TNM分期密切相關[15]。因此，本研究以人肺腺癌細胞A549為模型，研究Foxp3在肺腺癌中的作用及相關機制。

腫瘤發生發展的關鍵之一在于腫瘤細胞的無限增殖，其本質就是細胞周期調控紊亂。本研究結果顯示，Foxp3通過促進細胞G1期向S轉化從而促進細胞增殖。因此，Foxp3在肺腺癌中發揮促腫瘤細胞生長作用，并與腫瘤細胞周期調控紊亂有密切關系。細胞周期的調控是一個精細的生物學過程，有一個復雜的分子調控網絡。細胞周期進程主要由細胞周期蛋白(Cyclin)、細胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin-dependent kinase,CDK)和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物(Cyclin-dependent kinase inhibitor,CDKI)驅動[16]，在G0/G1、G2/M兩個關鍵性限制點進行調控。其中，cyclin和CDK為細胞周期正調控蛋白，CDKI為負調控蛋白。G0/G1期轉變標志DNA合成開始，G2/M期轉變標志有絲分裂開始，其中G1期向S期轉變更為重要。

本研究中我們發現，Foxp3可以促進A549細胞G1/S期checkpoint基因CCND1表達，從而促進細胞從G1期向S期轉化。CCND1是細胞周期調控蛋白家族的重要成員，屬于細胞周期素cyclin D家族，正向調控G0/G1期限制點，推動細胞從G1期進入S期，開始合成DNA，實現細胞的增殖過程[17]。CCND1的表達、激活、在核內的聚集全都發生在G1中期[18]。CCND1最初被發現于甲狀旁腺癌，是一種原癌基因，在乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌等多種腫瘤中通過基因擴增、基因重排及突變導致過表達[19-21]。腫瘤細胞CCND1過表達可縮短G1期，促進細胞從G1期向S期轉化，加速細胞周期進程，促進細胞分裂，引起細胞周期調控紊亂，導致細胞增殖異常，從而導致腫瘤發生發展[22]。在舌鱗狀細胞癌、乳腺癌等腫瘤中，CCND1對于淋巴結轉移及預后、提高診斷陽性率均有重要意義[23-25]。但在肺腺癌中，CCND1與腫瘤的發生發展及在肺腺癌中的表達情況一直存在爭議[26]。本研究中利用雙熒光素酶報告基因實驗證實了Foxp3可直接與CCND1啟動子結合，促進其轉錄，引起細胞周期調控紊亂，加速細胞周期進程，最終導致腫瘤細胞無限增殖。這與CCND1在乳腺癌、甲狀腺癌、膀胱癌等腫瘤中發揮促癌作用的結果是一致的。但Foxp3與CCND1具體的結合位點還需要進一步研究證實。

基于上述研究結果，我們證實了在人肺腺癌中，腫瘤細胞Foxp3可直接與CCND1啟動子結合，促進其轉錄，引起細胞周期調控紊亂，促進細胞從G1期向S期轉化，加速細胞周期進程，導致腫瘤細胞無限增殖促進其發展。以細胞周期調控分子為靶點的腫瘤治療已成為一個研究熱點，Foxp3通過CCND1調控細胞周期影響細胞增殖可為腫瘤治療提供新思路。

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[收稿2015-12-15]

(編輯 許四平)

Effect and mechanism of transcription factor Foxp3 on proliferation and cell cycle of human lung adenocarcinoma cell A549

LIU Ya-Qing,ZHAO Bo,LUO Ya-Dong,LI Yi-Nan，YANG Wei.Department of Immunology,Basic Medical College,Jilin University,Changchun 130021,China

Objective:To investigate the effect and mechanism of transcription factor Foxp3 on the proliferation and cell cycle of human lung adenocarcinoma cell line A549.Methods: We knocked down the expression of Foxp3 using siRNA.Foxp3 inhibition was detected by RT-PCR.Cell proliferation was detected by MTT.Cell cycle of A549 cells were detected by flow cytometry after the transfection of siRNA.Cell cycle-related checkpoint genes were filtered by RT-PCR.The regulation of Foxp3 on cell cycle-related checkpoint genes were detected by immunofluorescence and dual-luciferase reporter assay system.Results: The proliferation of A549 cells were inhibited after silencing Foxp3,and A549 cells were arrested in G0/G1cycle.G1/S cycle checkpoint gene CCND1 was down regulated.Mechanism research show that Foxp3 can regulate the expression of CCND1 directly.Conclusion: Foxp3 can promote the proliferation of A549 cell line by up regulating G1/S cycle checkpoint gene CCND1.This provides a new target for the therapeutic targets of lung adenocarcinoma.

Foxp3;CCND1;Lung adenocarcinoma;Proliferation;Cell cycle

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.009

劉亞慶(1990年-)，女，碩士，主要從事腫瘤免疫學研究，E-mail：yqliu13@jlu.edu.cn。

及指導教師：李祎南(1988年-)，女，博士，主要從事腫瘤免疫研究，E-mail：liyn13@mails.jlu.edu.cn。 楊 巍(1980年-)，女，博士，副教授，主要從事免疫耐受方面的研究，E-mail:ywei@jlu.edu.cn。

R730.3

A

1000-484X(2016)04-0490-05