二氫楊梅素抗感染性休克的作用與機制研究①

王 蕊 劉 娟 蘇曉慧 陳劍鈺 楊 芬 李 婷

(澳門科技大學中藥質量研究國家重點實驗室，澳門藥物與健康應用研究院，澳門999078)

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二氫楊梅素抗感染性休克的作用與機制研究①

王 蕊 劉 娟 蘇曉慧 陳劍鈺 楊 芬 李 婷

(澳門科技大學中藥質量研究國家重點實驗室，澳門藥物與健康應用研究院，澳門999078)

目的：探討二氫楊梅素(Dihydromyricetin,DMY)抗內毒素休克的作用及其機制。方法：小鼠給予DMY處理 7 d后，腹腔注射脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)建立小鼠休克模型，在LPS刺激24、48、72、96、120、144、168 h后統計小鼠的死亡率。體外培養RAW264.7細胞,以DMY(10、50、100 μmol/L)預處理細胞1 h 后給予LPS 100 ng/ml刺激細胞。利用Western blot技術檢測P-ERK、ERK、P-JNK、JNK、P-p38、p38蛋白的表達，免疫細胞化學技術檢測RAW264.7 巨噬細胞中c-Jun，c-Fos 的核轉錄。結果：與LPS誘導組相比，DMY明顯降低了LPS誘導小鼠感染性休克的死亡率；同時體外實驗結果顯示， DMY不僅可劑量依賴性抑制LPS誘導的RAW264.7細胞P-ERK 、P-JNK、P-p38和蛋白表達水平的上調。還可明顯抑制LPS誘導引起的RAW264.7細胞c-Jun，c-Fos蛋白核轉錄。結論：DMY可通過抑制 MAPK信號通路的磷酸化水平從而抑制c-Jun和c-Fos的激活，降低LPS誘導的小鼠感染性休克的死亡率。

二氫楊梅素；RAW264.7細胞；MAPK；脂多糖

廣西藤茶[Ampelopsis grossedentata (Hand.-Mazz) W.T.Wang]是葡萄科蛇葡萄植物顯齒葡萄的莖葉，是一種應用廣泛的藥用植物，具有清熱利濕、活血通絡、平肝降壓的功效。二氫楊梅素(dihydromyricetin,DMY)是廣西藤茶中的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、降血脂以及預防酒精肝等藥理作用[1-3]。據報道，其藥理作用與抑制葡萄糖轉運蛋白4(Glucose transporter 4,GLUT4)的核轉移、促進AMPKα(AMP-activated protein kinase α)的磷酸化以及對抗超氧陰離子自由基引起的氧化性損傷有關[4，5]。最近研究報道，DMY作為IKK的抑制劑，通過抑制T細胞活化，對小鼠遲發性超敏反應和大鼠關節炎發揮抑制作用[6]。但目前該化合物對LPS誘導的小鼠感染性休克尚無相關報道，其作用機理亦不清楚。

臨床上感染性休克主要源于LPS對巨噬細胞和單核細胞的過度活化[7]。作為一種重要免疫細胞，巨噬細胞參與很多種慢性炎癥反應疾病如：動脈粥樣硬化、神經退行性疾病等，并且在腫瘤發生、衰老的生理病理過程中具有重要作用。在外界因素的刺激下絲裂原蛋白激酶(Mitogen activation protein，MAPK)及IKK-NF-κB信號通路被激活，促進趨化因子的分泌，進一步造成IL-6和TNF-α，誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、環氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)等細胞因子和炎癥介質的分泌。RAW264.7細胞是一種鼠源性的單核巨噬細胞系，在受到外界因素如脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激時能夠合成并釋放大量的炎癥介質和炎癥因子，作為一種炎癥細胞模型而被廣泛用于炎癥研究。因此，本研究擬通過建立LPS誘導小鼠休克模型進行整體動物研究，同時建立LPS激活RAW264.7巨噬細胞的炎癥實驗模型探討 DMY的抗炎作用分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6～8周齡的雄性C57/BL6小鼠，購自廣東省實驗動物中心。

1.1.2 細胞株 小鼠來源的巨噬細胞株(RAW264.7)購自ATCC。

1.1.3 主要試劑 DMY分析標準品，HPLC≥98%(南京澤朗醫藥科技有限公司)；脂多糖 (LPS)、地塞米松(Sigma 公司)；c-Jun、c-Fos、P-ERK、ERK、P-JNK、JNK、P-p38、p38、辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(Cell signaling公司)；β-actin(Santa Cruz公司)；胎牛血清、DMEM(Gibco公司)； 羊抗兔熒光二抗(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠感染性休克模型的建立和分組 實驗動物被隨機分空白對照組、模型組、DMY組、DEX組。DMY組腹腔注射給藥7 d，在第7天DMY給藥1 h以及DEX給藥30 min后分別腹腔注射LPS(40 mg/kg)制備小鼠感染性休克模型[8]。之后每隔24 h觀察一次行為變化及死亡率，連續觀察7 d。

1.2.2 細胞培養 細胞用 DMEM 完全培養液(含10% 胎牛血清，含青霉素、鏈霉素各1 000 U/L)于5% CO2、37℃培養箱進行培養。細胞生長至80%融合后用于實驗。

1.2.3 DMY作用于LPS誘導的RAW264.7細胞 將處于對數生長期的RAW264.7細胞按1×106個/孔接種于6孔板中。24 h后待細胞生長至80%融合狀態，加入DMY至終濃度為10、50、100 μmol/L干預1 h，之后LPS刺激組和DMY給藥組均加入LPS，使其終濃度為100 ng/ml，正常對照組加入相同體積的培養基，繼續培養1 h后，收集細胞提取蛋白。

1.2.4 Western blot 檢測P-ERK、ERK、P-JNK、JNK、P-p38、p38蛋白的表達 10%SDS-PAGE膠電泳分離蛋白、電轉移法使蛋白轉移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST (Tris Buffered Saline with Tween 20) 室溫下封閉后加入相應蛋白的一抗，4℃過夜。TBST洗膜后以辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)標記的二抗(1∶2 000)孵育2 h，TBST洗膜后加ECL曝光顯影。

1.2.5 免疫熒光 在培養板中將已爬好細胞的玻片用磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffer saline,PBS)浸洗3次之后用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗3次×3 min。0.5%Triton X-100破膜5 min，PBS浸洗3次×3 min。每張玻片滴加DAPI(1∶200)，室溫避光孵育30 min后PBS浸洗3次×3 min。每張玻片滴加稀釋好的c-Fos 或 c-Jun抗體(1∶500)，37℃孵育2 h，PBS浸洗3次×3 min。滴加稀釋好的熒光二抗，室溫孵育1 h，PBS浸洗3次×3 min。避光封片，拍照。

2 結果

2.1DMY對LPS誘導的小鼠感染性休克模型的影響 結果如表1及圖1所示，模型組小鼠在給予致死劑量的LPS刺激后120h內全部死亡，死亡率為100%；100mg/kg的DMY治療組中13只小鼠，在給予致死劑量的LPS刺激后，至第5天時死亡率為53.8% ，即有6只小鼠存活，在第7天小鼠死亡率仍為53.8%，表明在5d之后，仍然存活的6只小鼠身體狀態恢復正常。50mg/kg的DMY治療組第2天至第5天的死亡率為58.3%，至第7天時12只小鼠有11只死亡，死亡率為91.7%，這一結果表明，DMY可抑制LPS誘導的小鼠死亡并呈劑量依賴性。

2.2DMY對LPS誘導的MAPKs信號通路的影響 如圖2A結果所示，未被LPS刺激的RAW246.7細胞并不能表達P-ERK,P-JNK以及P-p38。該細胞在給予LPS刺激1h以后，P-ERK、P-JNK、P-p38蛋白的表達顯著提高，與空白對照組相比有顯著性差異。加入DMY干預以后與LPS組相比，DMY可劑量依賴性抑制LPS誘導引起的RAW264.7細胞P-JNK、P-p38蛋白表達水平的上調，尤其在100 μmol/L DMY作用下，這一抑制作用最為明顯，三次結果統計分析如圖2B所示。但是該化合物對P-ERK則沒有明顯的抑制作用。雖然P-ERK、P-JNK及p38均屬于MAPKs家族，但是DMY對其抑制作用并不完全相同。

表1 DMY對LPS誘導的小鼠感染休克模型的影響

Tab.1 Effcet of DMY on LPS-induced septic shock model in mice

Mortalityrate24h48h72h96h120h144h168hModelgroup38.59%(5/13)61.5%(8/13)92.3%(12/13)92.3%(12/13)100%(13/13)100%(13/13)100%(13/13)DMY100mg/kggroup15.4%(2/13)23.1%(3/13)38.5%(5/13)46.2%(6/13)53.8%(7/13)53.8%(7/13)53.8%(7/13)DMY50mg/kggroup25%(3/12)58.3%(7/12)58.3%(7/12)58.3%(7/12)58.3%(7/12)75%(9/12)91.7%(11/12)DMY30mg/kggroup0%(0/12)0%(0/12)0%(0/12)0%(0/12)0%(0/12)0%(0/12)0%(0/12)

圖1 DMY對LPS誘導的小鼠感染性休克模型的影響Fig.1 Effect of DMY on LPS-induced septic shock model in mice

2.3 DMY對LPS誘導的c-Jun蛋白的影響 如上述結果所示，DMY能夠明顯抑制JNK磷酸化表達，而JNK可以調節核轉錄因子c-Jun的核轉移。因此在本研究中，我們進一步觀察DMY是否對c-Jun的核轉移產生影響。研究中采用免疫熒光技術觀察c-Jun的核內表達情況。實驗中，帶有綠色熒光抗體用于標記c-Jun，采用可與細胞核中雙鏈DNA結合而發揮標記作用的DAPI標記細胞核。如圖3 所示，帶有綠色熒光的c-Jun主要集中于細胞質當中，與DAPI所標記的細胞核不能重疊。與空白對照組相比，LPS刺激1 h可明顯增加c-Jun在細胞核內表達，與標記細胞核的DAPI發生重疊，表明LPS作用后可促進c-Jun的核轉移。加入100 μmol/L DMY干預以后，與LPS刺激組相比，c-Jun的在核內表達的熒光強度明顯減弱，更接近對照組水平，證明DMY可明顯抑制LPS誘導引起的RAW264.7細胞c-Jun蛋白的核轉錄。

2.4 DMY對LPS誘導的對c-Fos蛋白的影響

圖2 DMY對LPS誘導的RAW 264.7 細胞MAPKs磷酸化蛋白表達的影響Fig.2 Effect of DMY on LPS-induced related protein expression in RAW 264.7 cellsNote: Compared with LPS group,*.P<0.05.

c-Jun是可誘導的轉錄因子異二聚體AP-1的一種蛋白，另一個蛋白為c-Fos。我們的研究結果表明，DMY能夠明顯抑制c-Jun核轉錄，及其調節因子JNK的磷酸化。我們前期的研究結果顯示，DMY亦可抑制MAPK家族另一蛋白p38的活化，該蛋白可調節c-Fos的核轉錄，因此我們進一步觀察DMY是否能夠抑制c-Fos在細胞核中的表達。如圖4 所示，我們同樣采用帶有綠色熒光抗體標記c-Fos，采用DAPI定位細胞核。空白對照組中，帶有綠色熒光的c-Fos集中于細胞質當中。但是在LPS刺激1 h后，可明顯增加c-Fos在細胞核內表達。加入100 μmol/L DMY干預以后，與LPS刺激組相比，c-Fos的在核內表達的熒光強度明顯減弱，更接近對照組水平，證明DMY可明顯抑制LPS誘導引起的RAW264.7細胞c-Fos在細胞核內的表達。

圖3 DMY對LPS誘導的RAW264.7細胞 c-Jun蛋白核轉錄的影響Fig.3 Effect of DMY on LPS-induced c-Jun expression in RAW264.7 cells

圖4 DMY對LPS誘導的RAW264.7細胞 c-Jun核轉錄的影響Fig.4 Effect of DMY on LPS-induced c-Jun nucleus translocation in RAW264.7 cells

3 討論

黃酮類化合物廣泛存在于自然界的多種植物中。這類化合物具有多種活性，包括抗氧化、抗炎等作用。DMY是來源于中藥藤茶的一種黃酮類化合物，已經被報道具有抗炎鎮痛、抗癌、抗氧化及免疫調節等作用[9]。研究表明，該化合物可改善非酒精性脂肪肝患者的糖代謝、脂代謝及各項生化指標[10]。通過上調HO-1 (Heme oxygenase-1) 表達發揮抗氧化作用[5]，同時研究表明DMY的抗氧化活性和抗酸堿活性主要歸因于其結構中鄰三羥基群[11]。我們的前期研究結果表明，DMY通過結合于IKKβ第46位半胱氨酸，抑制IKKβ激酶活性，從而抑制T細胞活化，及相關細胞因子的分泌，達到免疫抑制作用[11]。巨噬細胞與T細胞同為機體重要的免疫細胞，是感染性休克的主要參與細胞。在本研究當中，我們觀察了DMY對LPS所導致的小鼠休克死亡率影響。實驗結果表明，DMY能夠明顯降低LPS所導致的小鼠休克死亡率，提示DMY可能通過抑制巨噬細胞活化從而抑制炎癥反應。巨噬細胞不僅本身參與炎癥反應，其分泌的炎癥因子COX-2、iNOS、TNF-α和 IL-1β等，亦與炎癥的進展密切相關[12]。已有研究報道，DMY可抑制iNOS,IL-6等炎癥因子的釋放，這一作用可歸因于抑制IKKβ-IKBα-NF-κB信號轉導通路[13]。

根據文獻報道，LPS所參與的跨膜信號受體TLR4不僅可通過IKKβ-NF-κB信號轉導通路 ，還可以通過MAPK信號轉導通路來調控LPS誘導的巨噬細胞活化[14]。MAPK所調節的轉錄因子AP-1(Activator protein-1,AP-1) 由c-Jun和c-Fos組成，是哺乳動物細胞中最早發現具有結合特異性序列的轉錄因子之一。c-Jun和c-Fos的活性可被多種刺激因素誘導，包括生長因子、炎性因子、細菌及病毒感染、各種理化刺激等。這些刺激因素可以通過活化的MAPK級聯反應促進多種底物磷酸化，激活c-Jun和c-Fos的瞬時表達[15]， 從而參與炎癥發生過程。其中c-Jun的轉錄活性是通過磷酸化其N端的絲氨酸-63和-73而獲得。外界的各種刺激，包括生長因子，細胞因子和UV輻射均可誘導其活化。JNK通過結合于c-Jun的活化區域，從而特異性磷酸化這兩個絲氨酸位點[16]。 我們的結果表明，DMY正是通過抑制MAPK家族中JNK的磷酸化，而產生抑制c-Jun核轉錄的作用。 c-Fos是組成AP-1二聚體中的另一個蛋白， MAPK家族中的p38在整體動物，及體外模型上均可磷酸化c-Fos的轉錄活化區域。在UV誘導活化的相關途徑中，外源性c-Fos不僅是p38的底物，其核內表達水平也可被p38所誘導，提示p38在介導c-Fos的磷酸化和基因轉錄活化方面，發揮關鍵作用[17]。我們的研究結果表明，DMY通過抑制p38活化，而達到抑制c-Fos蛋白的核內表達水平。

MAPK家族除JNK,p38以外，還包括ERK。雖然ERK活化亦可誘導促進c-Fos合成增加，轉入核內與已存在的c-Jun結合，形成AP-1異二聚體，增加AP-1活性[15]。但是我們研究發現DMY并不能影響ERK的磷酸化表達，綜上，我們的研究表明，DMY通過下調P-JNK和P-p38表達，抑制LPS誘導的c-Jun和c-Fos的核轉移，從而抑制巨噬細胞的活化，最終發揮抗炎作用并對LPS誘導的小鼠感染性休克產生保護作用。

[1] Zhang Y,Ning Z,Yang S,etal.Antioxidation properties and mechanism of action of dihydromyricetin from Ampelopsis grossedentata[J].Acta Pharmaceutica Sinica,2003,38(4):241-244.

[2] Zhang T,Mi M,Liang X,etal.Dihydromyricetin attenuates high glucose-induced oxidative stress in human umbilical vascular endothelial cells (1146.2)[J].FASEB J,2014,28(1 S):1146.

[3] Shen Y,Lindemeyer AK,Gonzalez C,etal.Dihydromyricetin as a novel anti-alcohol intoxication medication[J].J Neurosci,2012,32(1):390-401.

[4] Jiang B,Le L,Pan H,etal.Dihydromyricetin ameliorates the oxidative stress response induced by methylglyoxal via the AMPK/GLUT4 signaling pathway in PC12 cells[J].Brain Res Bull,2014，109：117-126.

[5] Kou X,Shen K,An Y,etal.Ampelopsin Inhibits H2O2-induced apoptosis by ERK and Akt signaling pathways and up-regulation of heme oxygenase-1[J].Phytother Res,2012,26(7):988-994.

[6] Li T,Wong V,Jiang ZH,etal.Mutation of cysteine 46 in IKK-beta increases inflamma-tory responses[J].Oncotarget,2015,6(31):31805-31819.

[7] Shapira L,Soskolne WA,Houri Y,etal.Protection against endotoxic shock and lipopolysaccharide-induced local inflammation by tetracycline:correlation with inhibition of cytokine secretion[J].Infect Immunity,1996,64(3):825-828.

[8] Zuckerman SH,Bendele AM.Regulation of serum tumor necrosis factor in glucocorticoid-sensitive and-resistant rodent endotoxin shock models[J].Infect Immunity，1989,57(10):3009-3013.

[9] Nijveldt RJ,Van Nood E,Van Hoorn DE,etal.Flavonoids:a review of probable mechanisms of action and potential applications[J].Ame J Clin Nutr,2001,74(4):418-425.

[10] Chen S,Zhao X,Wan J,etal.Dihydromyricetin improves glucose and lipid metabolism and exerts anti-inflammatory effects in nonalcoholic fatty liver disease:a randomized controlled trial[J].Pharmacol Res,2015,99：74-81.

[11] Xin M,Ma Y,Xu K,etal.Structure-activity relationship for dihydromyricetin as a new natural antioxidant in polymer[J].J Appl Polym Sci,2013,128(3):1436-1442.

[12] Won JH,Im HT,Kim YH,etal.Anti-inflammatory effect of buddlejasaponin IV through the inhibition of iNOS and COX-2 expression in RAW 264.7 macrophages via the NF-κB inactivation[J].Br J Pharmacol,2006,148(2):216-225.

[13] Hou X,Tong Q,Wang W,etal.Suppression of inflammatory responses by dihydromyricetin,a flavonoid from ampelopsis grossedentata,via inhibiting the activation of NF-κB and MAPK signaling pathways[J].J Nat Prod,2015,78(7):1689-1696.

[14] Jiang Q,Akashi S,Miyake K,etal.Cutting edge:Lipopolysaccharide induces physical proximity between CD14 and Toll-like receptor 4 (TLR4) prior to nuclear translocation of NF-κB[J].J Immunol,2000,165(7):3541-3544.

[15] Karin M.The regulation of AP-1 activity by mitogen-activated protein kinases[J].J Biol Chem，1995,270(28):16483-16486.

[16] Minden A,Lin A,Smeal T,etal.c-Jun N-terminal phosphorylation correlates with activation of the JNK subgroup but not the ERK subgroup of mitogen-activated protein kinases[J].Mol Cell Biol,1994,14(10):6683-6688.

[17] Tanos T,Marinissen MJ,Leskow FC,etal.Phosphorylation of c-Fos by Members of the p38 MAPK family role in the AP-1 response to UV ligh[J].J Biol Chem,2005,280(19):18842-18852.

[收稿2016-01-20]

(編輯 許四平)

Study on anti-inflammatory effect and underlying mechanism of DMY in LPS-induced septic mice

WANG Rui,LIU Juan,SU Xiao-Hui,CHEN Jian-Yu，YANG Fen,LI Ting.State Key Laboratory of Quality Research in Macau Institute for Applied Research in Medicine and Health,Macau University of Science and Technology,Macau 999078,China

Objective:To investigate the effect of dihydromyricetin (DMY) on LPS-induced septic shock in mice and the related underlying mechanism.Methods: The LPS-induced septic shock mice model was established after the mice were pre-treated by DMY for 7 days.The mortality rate was calculated at 24,48,72,96,120,144 and 168 h after the mice were intraperitoneal injected with LPS.For elucidation of underlying mechanism,RAW246.7 were pre-incubated with DMY for 1 h,and then stimulated by LPS 100 ng/ml.Western blot was performed for determination of P-ERK,P-JNK and P-p38 expression.Immunohistochemistry was applied to explore c-Fos and c-Jun nucleus translocation.Results: DMY could significantly inhibit LPS-induced mice mortality.Inhibitory effect of DMY on the phosphorylation of JNK and p38 contributed to the anti-inflammatory effect of DMY in vivo.Furthermore,DMY obviously prevented c-Fos and c-Jun nucleus translocation.Conclusion: The anti-inflammatory effect of DMY is attributed to the suppression on c-Fos and c-Jun nucleus translocation,via inhibition of the phosphorylation of JNK and p38.

Dihydromyricetin;RAW264.7;MAPK;Lipopolysaccharide

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.003

①本文受澳門科技發展基金資助(081/2013/A3)。

王 蕊(1988年-)，女，博士，主要從事中藥抗炎與免疫藥理方面的研究，E-mail：ruiwang853@gmail.com。

及指導教師：李 婷(1980年-)，女，博士，助理教授，博士生導師，主要從事中藥抗炎與免疫藥理方面的研究，E-mail：tli@must.edu.mo。

R96

A

1000-484X(2016)04-0465-05