大蒜素對心肌纖維化的影響及對TLR4/NF-κB信號通路的作用

藍景生 張 震 羅 薇 覃梓慶 趙艷英

(廣西民族醫院心血管內科，南寧530001)

?

大蒜素對心肌纖維化的影響及對TLR4/NF-κB信號通路的作用

藍景生 張 震①羅 薇①覃梓慶 趙艷英

(廣西民族醫院心血管內科，南寧530001)

目的：研究大蒜素對AngⅡ誘導心肌成纖維細胞增殖和膠原蛋白分泌的作用，并探討其對TLR4/NF-κB信號通路的影響。方法：采用體外AngⅡ誘導心肌成纖維細胞增殖模型，用MTT法檢測細胞增殖能力，采用ELISA法觀察細胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的分泌，采用RT-PCR技術測定TLR4和NF-κB mRNA的表達，采用Western blot法檢測TLR4和NF-κB 蛋白的表達。結果：(1)大蒜素可以抑制AngⅡ誘導CF增殖，并且具有劑量依賴性(P<0.01)；(2) 大蒜素可以抑制AngⅡ誘導CF分泌Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白，并且具有劑量依賴性(P<0.01)；(3)大蒜素可以抑制AngⅡ誘導CF表達TLR4和NF-κB mRNA；(4)大蒜素可以抑制AngⅡ誘導CF表達TLR4和NF-κB 蛋白。結論：大蒜素可通過抑制心肌成纖維細胞增殖和減少膠原蛋白分泌而具有潛在的抗心肌纖維化作用，其作用可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路有關。

大蒜素；心肌成纖維細胞；TLR4/NF-κB信號通路

心肌纖維化(Myocardial fibrosis，MF)是心血管疾病心肌重構的重要機制[1]。盡管目前對于MF發生的機制尚不十分明確，心肌成纖維細胞(Cardiac fibroblasts，CF)的異常增殖和膠原合成過度增加是其主要病理特征。CF在心肌組織中含量最多，在維持心臟結構和功能發揮方面起重要作用[2]。腎素-血管緊張素-醛固酮系統的過度激活是導致心肌纖維化的重要因素之一，血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)可刺激膠原合成，誘導CF增殖，在心肌纖維化中發揮重要作用[3,4]。大蒜素是大蒜中的主要生物活性物質，是多種含硫化合物的復合體。大蒜素在對心血管保護作用方面已有諸多研究，此外已有研究顯示大蒜素可抑制大鼠心肌肥厚過程中的反應性纖維化，其作用可能與TGFβ-Smads信號通路有關[5]。炎性反應在心肌纖維化的形成過程中發揮重要的作用，心肌組織在炎性因子的作用下發生纖維化，而心肌纖維化后進一步刺激炎性因子的分泌，從而導致惡性循環。Toll樣受體4/轉錄因子-κB(Toll-like receptor 4/nuclear factor-κB，TLR4/NF-κB)是與炎癥密切相關的信號通路[6]。TLR是心血管疾病發展與免疫系統之間的橋梁，其中TLR4被認為與人類心血管疾病關系最為密切，TLR4是介導心肌炎癥信號的重要受體，TLR4的活化可使NF-κB的表達增加，進而引起一系列炎性因子的表達，并且NF-κB的活性對TLR4也具有調節作用。大蒜素調節CF是否有TLR4/NF-κB信號通路的參與目前尚無研究報告。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 Wistar大鼠乳鼠，年齡為1～3 d，雌雄各半，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK桂2003-0003。

1.1.2 主要藥物 大蒜素注射液(15 mg/ml，徐州萊恩藥業有限公司，批號201401016)；TAK242(TRL4拮抗劑，日本Takeda公司，100 μg/L)，LPS(TRL4激動劑，美國R&D 公司產品，100 ng/ml)。

1.1.3 主要試劑 胰蛋白酶、AngⅡ、DMEM培養液、MTT試劑(美國Sigma公司)，膠原酶(美國Sigma-Aldrich)，胎牛血清(英國Gibco公司)，鼠抗人波形蛋白單克隆抗體、對氨基聯苯胺(DBA)底物顯色試劑盒、鼠抗人平滑肌肌動蛋白(北京中杉金橋生物公司)，Ⅰ型前膠原羧基端肽酶聯免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒、Ⅲ型前膠原羧基端肽ELISA試劑盒(美國BPB 公司)，Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，反轉錄試劑盒、Real-Time PCR 試劑盒(日本TaKaRa公司)，兔抗人TRL4單克隆抗體(Cell signaling公司)，兔抗人NF-κB 單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，HRP-羊抗鼠二抗、FITC-羊抗鼠二抗、β-actin多克隆抗體(美國Abgent公司)，ECL化學發光試劑(碧云天生物技術公司)，低溫高速離心機(德國Heraeus公司)。

1.1.4 主要儀器 GI6-2恒溫培養箱(美國SHELLAB公司)，CK2型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，ABI 7500 PCR 擴增儀、凝膠成像系統、Western blot電泳儀(美國Bio-Rad公司)，酶標儀(德國BMG公司)，FluorChemQ蛋白印跡成像和定量分析系統(美國Alpha公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠CF細胞培養 將領回的乳鼠立即處死，在無菌條件下打開胸腔，取出心室，用冷PBS溶液洗凈心腔內殘血，剪碎，反復沖洗后，加入胰蛋白酶和膠原酶消化，每8 min收集1次細胞，直至組織塊消失。將所得全部細胞加入含胎牛血清的DMEM培養液中于5 %CO2、37℃恒溫培養箱中培養。由于CF和心肌細胞貼壁速度不同，差速貼壁2 h，傾去上清液可得CF，重新加入培養液培養，經倒置顯微鏡、免疫組化、纖維黏連蛋白染色陽性和平滑肌肌動蛋白染色陰性鑒定為CF，純度達98%。待原代細胞長滿瓶壁后加入胰蛋白酶消化并進行傳代培養，實驗采用第3～5代的細胞。取對數生長期CF制備為單細胞懸液，調整細胞濃度為5×107L-1后接種于96孔板，每孔接種1 ml，培養48 h后換無血清DMEM同步化24 h后進行實驗。每組均設6個復孔，除正常對照組外其他各組培養基均含1 μmol/L Ang Ⅱ。

1.2.2 MTT測定CF增殖 實驗分為5組，分別為正常對照組，模型對照組，大蒜素10、20和40 μg/L組。各組細胞培養12、24、48 h后每孔加入MTT溶液(5 mg/ml) 20 μl，37℃培養4 h，棄上清，加入100 μl DMSO，酶標儀450 nm波長測吸光度A值。

1.2.3 ELISA測定膠原蛋白的表達 實驗分為5組，分別為正常對照組，模型對照組，大蒜素10、20和40 μg/L組。將96孔板置于5 % CO2、37 ℃培養箱內分別培養48 h，分別吸取細胞上清液，根據Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的ELISA試劑盒說明書的操作說明進行檢測。

1.2.4 RT-PCR法測定TLR4和NF-κB mRNA的表達 實驗分為3組，分別為正常對照組，模型對照組和大蒜素20 μg/L組。將培養板置于5%CO2、37 ℃培養箱內分別培養48 h。Trizol提取細胞總RNA，用酶標儀進行定量，控制A260/A280在1.9～2.1，逆轉錄成cDNA。逆轉錄條件：30℃10 min，42℃ 30 min，95℃ 5 min。PCR引物序列見表1，RT-PCR操作按照說明書進行擴增。反應條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，72℃ 10 min，循環35次。PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠自動成像儀進行成像并分析，各目的基因的表達量以內參物GAPDH的相對定量表示。

1.2.5 Western blot法測定TLR4和NF-κB蛋白的表達 取對數生長期CF懸液，制備單細胞懸液調整細胞濃度為5×107L-1接種于96孔板，每孔接種1 ml，培養48 h后換無血清DMEM同步化24 h，分組進行實驗。實驗分為3組，分別為正常對照組，模型對照組和大蒜素20 μg/L組，每組設6個復孔。除正常對照組外，其他2組培養基均含10-3mol/Ang Ⅱ。將96孔板置于5%CO2、37 ℃培養箱內分別培養48 h。收集各組細胞，加入RIPA裂解液(含1 mmol/L PMSF，)于冰浴30 min，離心(2 000 r/min，30 min)后取上清液，用BCA法測定蛋白濃度。制備10%的分離膠和 5%濃縮膠，每孔加30 μg總蛋白進行SDS-PAGE垂直凝膠電泳分離不同相對分子質量蛋白質，將蛋白質轉載到硝酸纖維素(PVDF)膜上，經過5%脫脂奶粉在室溫條件下封閉2 h，洗膜并在4℃分別加入一抗(TRL4抗體、兔抗人NF-κB抗體、和羊抗鼠β-actin抗體)孵化過夜。復溫后洗膜，加二抗封閉90 min，洗膜，化學發光、顯影和定影，采用FluorChemQ多功能成像和定量分析系統曝光、采集圖像。以β-actin為內參，用目的蛋白吸光值與內參吸光度值的比值代表目的蛋白的相對表達含量。

表1 引物序列和產物長度

Tab.1 Primer sequence and product length

PrimerSequenceProductlength(pb)TLR4Forward:5'-GACCCAGATCATGTTTGAGA-3'295Reverse:5'-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3'NF-κBForward:5'-CCAAAGACCCACCTCACC-3'236Reverse:5'-CGCATTCAAGTCATAGTC-3'GAPDHForward:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'450Reverse:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'

2 結果

2.1 對AngⅡ誘導CF增殖的影響 與正常對照組比較，模型對照組在培養12、24和48h時吸光度OD值較正常對照組顯著升高(P<0.01)，說明AngⅡ可顯著誘導CF細胞增殖。大蒜素10μg/L組在培養12、24和48h時吸光度OD值與模型對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05)，而大蒜素20和40μg/L組在培養12、24和48h時吸光度OD值均較模型對照組顯著降低(P<0.01)，并且大蒜素40μg/L組的吸光度OD值均較大蒜素20μg/L組顯著降低(P<0.01)，說明大蒜素20和40μg/L可顯著抑制AngⅡ誘導的CF增殖，并且具有劑量依賴性。見表2。

2.2 對AngⅡ誘導CF表達Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白的影響 與正常對照組比較，模型對照組在48h時Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白較正常對照組顯著升高(P<0.01)，說明AngⅡ可顯著誘導CF細胞表達Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白。大蒜素10μg/L組在培養12、24和48h時Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白與模型對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05)，而大蒜素20和40μg/L組在培養12、24和48h時Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白均較模型對照組顯著降低(P<0.01)，并且大蒜素40μg/L組的Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白均較大蒜素20μg/L組顯著降低(P<0.01)，說明大蒜素20和40μg/L可顯著抑制CF細胞表達Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白，并且具有劑量依賴性。見表3。

2.3 對AngⅡ誘導CF表達TLR4和NF-κBmRNA的影響 與正常對照組比較，模型對照組在培養48h時TLR4和NF-κBmRNA較正常對照組顯著升高(P<0.01)，說明AngⅡ可顯著誘導CF細胞表達TLR4和NF-κBmRNA。大蒜素20μg/L組在培養48h時TLR4和NF-κBmRNA均較模型對照組顯著降低(P<0.01)，說明大蒜素20μg/L可顯著抑制CF細胞表達TLR4和NF-κBmRNA。見表4。

2.4 對AngⅡ誘導CF表達TLR4和NF-κB蛋白的影響 與正常對照組比較，模型對照組在培養48h時TLR4和NF-κB蛋白較正常對照組顯著升高(P<0.01)，說明AngⅡ可顯著誘導CF細胞表達TLR4和NF-κB 蛋白。大蒜素20 μg/L組在培養48 h時TLR4和NF-κB 蛋白均較模型對照組顯著降低(P<0.01)，說明大蒜素20 μg/L可顯著抑制CF細胞表達TLR4和NF-κB 蛋白。見表5。

表2 大蒜素對AngⅡ誘導CF增殖的影響(n=6)

Tab.2 Effect of allicin to proliferation of CF induced by Ang Ⅱ(n=6)

GroupsAngⅡODofabsorbanceCulturefor12hCulturefor24hCulturefor48hNormalcontrol-0.224±0.0180.384±0.0350.397±0.032Modelcontrol1μmol/L0.312±0.0211)0.565±0.0471)0.584±0.0421)Allicin10μg/L1μmol/L0.308±0.0210.557±0.0340.576±0.034Allicin20μg/L1μmol/L0.267±0.0252)3)0.468±0.0322)3)0.482±0.0412)3)Allicin40μg/L1μmol/L0.211±0.0112)3)4)0.363±0.0312)3)4)0.386±0.0362)3)4)

Note：Compared with normal control group,1)P<0.01;compared with model control group,2)P<0.01;compared with Allicin 10 μg/L group,3)P<0.01;compared with Allicin 20 μg/L group,4)P<0.01.

表3 大蒜素對AngⅡ誘導CF表達Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白的影響(n=6)

Tab.3 Effect of allicin to collagen Ⅰ and Ⅲ in CF induced by Ang Ⅱ (n=6)

GroupsAngIICollagenⅠ(ng/L)CollagenⅢ(μg/L)Normalcontrol-347.46±48.566.24±0.53Modelcontrol1μmol/L1178.64±154.381)12.74±1.181)Allicin10μg/L1μmol/L1045.36±134.6211.54±1.02Allicin20μg/L1μmol/L735.27±117.842)3)9.46±0.642)3)Allicin40μg/L1μmol/L497.42±78.422)3)4)7.43±0.582)3)4)

Note：Compared with normal control group,1)P<0.01;compared with model control group,2)P<0.01;compared with Allicin 10 μg/L group,3)P<0.01;compared with Allicin 20 μg/L group,4)P<0.01.

表4 大蒜素對AngⅡ誘導CF表達TLR4和NF-κB mRNA的影響(n=6)

Tab.4 Effect of allicin to TLR4 and NF-κB mRNA in CF induced by Ang Ⅱ(n=6)

GroupAngⅡTLR4mRNANF-κBmRNANormalcontrol-0.42±0.060.36±0.05Modelcontrol1μmol/L0.73±0.071)0.65±0.061)Allicin20μg/L1μmol/L0.52±0.052)0.44±0.042)

Note：Compared with normal control group,1)P<0.01;compared with model control group,2)P<0.01.

表5 大蒜素對AngⅡ誘導CF表達TLR4和NF-κB 蛋白的影響(n=6)

Tab.5 Effect of allicin to TLR4 and NF-κB protein in CF induced by Ang Ⅱ(n=6)

GroupsAngⅡTLR4proteinNF-κBproteinNormalcontrol-0.54±0.080.43±0.06Modelcontrol1μmol/L0.94±0.091)0.82±0.081)Allicin20μg/L1μmol/L0.63±0.072)0.62±0.072)

Note：Compared with normal control group,1)P<0.01;compared with model control group,2)P<0.01.

3 討論

正常心肌結構的2/3是非心肌細胞，其中CF占非心肌細胞總數的90%。CF遍布于整個心肌組織，包繞心肌細胞并連接細胞間質[7]。除了對心肌細胞的結構支持和保護作用外，CF還具有自分泌和旁分泌功能[8]。心臟膠原細胞主要由CF分泌，因此是維持心臟重塑的主要調節因素[9,10]。當各種原因引起心肌損傷時，心肌細胞體積增大、成纖維細胞增殖及分化、膠原分泌增加，參與組織修復并且成為主要的代償方式維持正常的心臟功能。但是CF異常增殖、膠原合成過度將導致進行性MF，降低心肌順應性，導致心臟功能障礙[11]。MF是多種心臟疾病的病理基礎，可致心力衰竭、心律失常、心源性猝死等[12]。因此，如何防止CF異常增殖及膠原過度合成，逆轉心肌纖維化，是保護心臟的關鍵因素之一，具有重要的研究意義。大蒜素是大蒜中存在的一種含硫化合物的特有成分，是多種含硫化合物的復合體。大蒜素是大蒜的主要有效成分，具有抗病原微生物、抗腫瘤、提高機體免疫力、預防心腦血管疾病、抗氧化、抑制肝纖維化[13]。但是目前關于大蒜素抑制心臟纖維化作用尚無研究報告。心肌成纖維細胞是MF的主要效應細胞，在MF發生、發展中起著重要作用[14]。本研究結果顯示，大蒜素可以抑制AngⅡ誘導CF增殖以及分泌Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白，并且具有劑量依賴性(P<0.01)，說明大蒜素具有潛在的抗心臟纖維化作用。

在心血管疾病的發生和發展過程中炎癥反應的作用不容忽視，已有研究顯示炎癥反應可導致高血壓病人心肌纖維化，表現為間質中膠原沉積增多以及各型膠原比率、排列紊亂[15]。心肌纖維化進程中由于免疫機制的激活而產生和釋放多種活性炎性因子，從而引起一系列與心肌纖維化有關的病理生理變化。TLR4是信號轉導家族的成員之一，在外源性LPS或內源性配體的刺激下，TLR4與接頭蛋白MyD88結合后再與白細胞介素相關激酶(IRAKs)結合，啟動與天然免疫和炎癥反應有關的基因轉錄，誘導機體免疫應答效應[16,17]。NF-κB位于TLR下游信號通路，是炎癥反應中最關鍵的轉錄調控因子之一，參與免疫反應及細胞增殖與分化等過程，在細胞代謝和免疫反應中均起重要作用。本研究結果顯示，大蒜素可以抑制Ang Ⅱ誘導CF細胞TLR4和NF-κB mRNA和蛋白的表達(P<0.01)，說明大蒜素對CF的作用可能參與了TLR4/NF-κB信號通路。

總之，大蒜素可通過抑制心肌成纖維細胞增殖和減少膠原蛋白分泌而具有潛在的抗心肌纖維化作用，其作用可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路有關。

[1] Porter KE,Turner NA.Cardiac fibroblasts:at the heart of myocardial remodeling[J].Pharmacol Ther,2009,123(2):255-278.

[2] Banerjee K，Yekkala K，Borg TK，etal.Dynamic interactions between myocytes,fibroblasts，and extracellular matrix [J]. Ann NY Acad Sci，2006，108：76-84.

[3] Olson ER,Shamhart PE,Naugle JE,etal.Angiotensin II-induced extracellular signal-regulated kinase 1/2 activation is mediated by protein kinase Cdelta and intracellular Calcium in adult rat cardiac fibroblasts[J].Hypertension,2008,51(3):704-711.

[4] Wang LP,Wang Y,Zhao LM,etal.Angiotensin Ⅱ upregulatesKCa3.1 channels and stimulates cell effort in rat cardiac fibroblasts[J].J Biochem Pharmacol,2013,85(10):1486-1494.

[5] 張海嘯,史載祥,賈海忠,等.大蒜素通過部分阻抑TGF-β_1介導的Smads信號改善壓力超負荷大鼠心肌反應性纖維化[J].中國中西醫結合雜志,2012,32(5):666-670.[6] 姚 嵐,肖 揚,劉石平,等.肥胖癥患者血清對人源單核細胞細胞上Toll樣受體4/轉錄因子-κB信號通路的影響[J].中華醫學雜志,2010,90(44):3119-3123.

[7] Souders CA,Bowers SL,Baudino TA.Cardiac fibroblast:the Renaissance cell[J].Circ Res,2009,105(12):1164-1176.

[8] Brown RD,Ambler SK,Mitchell MD,etal.The cardiac fibroblast:therapeutic target in myocardial remodeling and failure[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol,2005,45(5):657-687.

[9] Mir SA,Chatterjee A,Mitra A,etal.Inhibition of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) attenuates interleukin-6 (IL-6)-induced collagen synthesis and resultant hypertrophy in rat heart[J].J Biol Chem,2012,287(4):2666-2677.

[10] Wu W,Muchir A,Shan J,etal.Mitogen-activated protein kinase inhibitors improve heart function and prevent fibrosis in cardiomyopathy caused by mutation in lamin A/C gene[J].Circulation,2011,123(1):53-61.

[11] Cheng S,Vasan RS.Advances in the epidemiology of heart failure and left ventricular remodeling[J].Circulation,2011,124(20):e516-e519.

[12] Ruige JB,Mahmoud AM,De Bacquer D,etal.Endogenous testosterone and cardiovascular disease in healthy men:a meta-analysis[J].Heart,2011,97(11):870-875.

[13] 葉 靜,周曉明,張 立,等.大蒜素防治大鼠肝纖維化的效果及其機制探討[J].山東醫藥,2015,55(16):5-7,111.

[14] 戴 斌,崔 猛,張 宏.高糖狀態下心肌成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原表達變化的觀察[J].重慶醫學,2013,42(15):1724-1726.

[15] 吳金風.Binay KA,孟曉萍.CD8+效應性T細胞促高血壓心肌纖維化的炎性反應[J].中國實驗診斷學,2012,16(2):276-277.

[16] Kaushal V,Schlichter LC.Mechanisms of microglia-mediated neurotoxicity in a new model of the stroke penumbra[J].J Neurosci,2008,28(9):2221-2230.

[17] O′Neill LA，Bryant CE，Doyle SL.Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases andcancer，Pharmacol Rev，2009，61：177-197.

[收稿2015-08-20 修回2015-09-15]

(編輯 倪 鵬)

Effects of Allicin on myocardial fibrosis and TLR4/NF-κB pathway

LAN Jing-Sheng,ZHANG Zhen,LUO Wei,QIN Zi-Qing,ZHAO Yan-Ying.Department of Cardiovascular,Guangxi Nationalities Hospital,Nanning 530001,China

Objective:To observe the effect of Allicin in cardial fibroblasts(CFs) proliferation and Collagen secretion,and to explore its role on TLR4/NF-κB signal pathway.Methods: CFs of neonatal Wistar rats were isolated and cultured,then was stimulated with AngⅡ.CFs proliferation was measured by thiazolyl blue(MTT) assay.The expression of collagenⅠ,collagenⅢ was measured by ELISA.mRNA expression of TLR4 and NF-κB were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction,protein expression of TLR4 and NF-κB were detected with Western blot.Results: Allicin could reduced MTT value of cardial fibroblasts(P<0.01),and inhibited expression of collagenⅠ,collagenⅢ(P<0.01),which in a dose-dependent manner.Allicin could reduced mRNA expression of TLR4 and NF-κB and protein expression of TLR4 and NF-κB in CF induced by Ang Ⅱ (allP<0.01) .Conclusion: Allicin can inhibit Myocardial fibrosis ,which mechanism is possible by inhibiting TLR4/NF-κB signal pathway.

Allicin;Cardiac fibroblasts; Toll like receptor-4/Nuclear factor-κB

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.011

藍景生(1969年-)，男，博士，主任醫師，主要從事心肌疾病炎癥反應方面的研究。

R285.5

A

1000-484X(2016)04-0500-05

①右江民族醫學院附屬醫院心血管內科，百色533000。