HSPC238對HMOX1、RPS27a、MT2A、UBB調節的初步研究①

譚家余 黃 湘 陳敬林 鐘裕恒

(南方醫科大學第三臨床醫學院 南方醫科大學附屬中山博愛醫院，中山528403)

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·生物治療·

HSPC238對HMOX1、RPS27a、MT2A、UBB調節的初步研究①

譚家余 黃 湘 陳敬林 鐘裕恒

(南方醫科大學第三臨床醫學院 南方醫科大學附屬中山博愛醫院，中山528403)

目的：探討HSPC238過表達或低表達對目標蛋白(HMOX1、MT2A、UBB、RPS27a)的調節作用及其調節途徑。方法：分別構建HSPC238的干擾載體及高表達載體，脂質體法轉染HEPG2細胞株，RT-PCR、Western blot檢測HSPC238及目標蛋白的mRNA、蛋白的表達量；進一步用目標蛋白的高表達質粒分別轉染低表達及高表達HSPC238的HEPG2細胞株，實驗組另以蛋白酶體抑制劑MG132處理細胞，鎳柱純化目標蛋白，以HSPC238做免疫印跡，檢測目標蛋白累積情況。結果：外源性干擾HSPC238后HMOX1、MT2A、RPS27a表達下調較明顯，外源性過表達HSPC238后MT2A、UBB、RPS27a表達水平明顯上調；目標蛋白的高表達質粒分別轉染低表達及高表達HSPC238的HEPG2細胞株，實驗組以蛋白酶體抑制劑MG132處理細胞后，與對照組比較，泛素化的目標蛋白條帶明顯增加。結論：過表達HSPC238可上調MT2A、UBB、RPS27a的表達，干擾HSPC238可下調HMOX1、MT2A、RPS27a的表達；HSPC238可能通過泛素蛋白酶體途徑(Ubiquitin-proteasome pathway，UPP)對目標蛋白發揮調節作用。

HSPC238；泛素蛋白酶體途徑；目標蛋白

HSPC238蛋白(hypothetical protein LOC51255，ring finger protein 181，NP_057578)是由LOC51255基因(NM_016494)編碼的含153個氨基酸的，包含RING指(RING-type zinc finger)結構域的蛋白質，屬于C3HC4型鋅指蛋白，其特殊的結構提示該蛋白可能參與泛素蛋白酶體途徑。本課題組在前期研究中發現，HSPC238蛋白在體內外均可明顯抑制肝癌細胞的生長[1]，并進一步通過酵母雙雜交的方法篩選到了與HSPC238相互作用的目標蛋白(HMOX1、MT2A、UBB、RPS27a)[2]。本研究擬進一步探討HSPC238對目標蛋白的調節及其調節途徑，為深入研究HSPC238在肝癌發生中的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒及細胞株 pCDNA3.1-HSPC238-Flag；pCDNA3.1-HMOX1-His；pCDNA3.1-MT2A-His；pC-DNA3.1-RPL5-His；pCDNA3.1-UBB-His；pCDNA-3.1-RPS27A-His、HEPG2細胞株等由本課題組前期已合成。

1.1.2 抗體 HSPC238、HMOX、RPS27A、MT2A、UBB、Goat-anti-mouse-HRP、Goat-anti-Rabbit-HRP、mouse anti-Flag mAb、兔抗Ubiquitin B、兔抗MT2A、兔抗RPS27、兔抗HMOX1均購自ABCLONAL;mouse anti-actin(Epitomics);羊抗鼠和羊抗兔二抗(Abmart)。

1.1.3 基礎試劑 細胞基礎培養基、FBS胎牛血清、雙抗、Lipfecti mine 2000轉染試劑、MG132、Ni-NTA sefinose Resin(生工生物工程)；Tricine Lipofecta mine 2000、PMSCV-puro、嘌呤霉素、DMEM/高糖基礎培養基，FBS。逆轉錄酶，Real-time PCR試劑盒、TRIZOL購自鐘鼎生物；氯仿、異丙醇(分析純)；RNA溶解液(全式金)；DEPC(PMSF Amresco)；引物合成(上海生工)，cocktail(上海源葉生物科技有限公司)；PBS(pH7.0,自配)；脫脂奶粉(伊利)，DMEM/高糖培養基，購自Gibco公司；FBS、Penicillin和Streptomycin購自Hyclone公司；Trypsogen購自Worthington公司。

1.2 方法

1.2.1 穩定過表達及低表達HSPC238蛋白細胞株的篩選 轉染前24 h，將細胞接種于5 ml不含抗生素的H-DMEM培養基中，使其在轉染時長至70%～80%融合。參照Lipofecta mineTM2000產品說明書，分別將目的質粒轉染至六孔板培養基，37℃、5% CO2孵育6 h后，換用新鮮完全培養基繼續培養48 h后加入2 μg/ml嘌呤霉素篩選。初期每天更換新鮮含有2 μg/ml培養基,5 d后視培養基顏色變化來換液，當出現克隆后挑出克隆，擴增培養，并細胞凍存以便后續實驗。

1.2.2 總RNA提取及RT-PCR實驗 收集擴增培養72 h后的各組細胞(分成兩份，一份用于RT-PCR、一份用于WB)，按照總RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA。采用SYBR Green法進行RT-PCR實驗，各個目的基因引物序列及產物大小見下表。

反應程序：95℃，3 min；95℃，30 s；55℃，20 s；72℃，20 s；72℃，10 min；共35個循環，同一實驗重復3次，統計學分析采用的是相對定量，采用RQ=2-△CT計算相對表達量，EXCLE分析數據，Graphpad prism 5軟件作圖。

1.2.3 蛋白提取及WB實驗 收集擴增培養72 h后的各組細胞(分成兩份，一份用于RT-PCR、一份用于WB)，加入細胞裂解液提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。加入SDS上樣緩沖液100℃，處理5 min；每孔上樣100 μg，70 V恒壓SDS-Page電泳，100 V冰水混浴，電轉至PVDF膜，5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗(六種抗體分別稀釋為1∶500；β-actin為1∶1 000)，4℃冰箱過夜，次日TBST漂洗10 min×3次，加入HRP標記的二抗(羊抗鼠1∶5 000，羊抗兔1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST漂洗10 min×3次，ECL化學發光顯影。

1.2.4 HSPC238對目標蛋白的泛素化調節 接種步驟1.2.1中的HepG2穩轉細胞株，0.25%胰酶消化至細胞密度為60%～70%。參照Lipofecta mineTM2000產品說明書，將目標質粒(pcDNA3.1/HMOX1/MT2A/RPS27A/UBB)分別轉染至細胞，37℃吸附5 h，更換新鮮完全培養基。繼續培養48 h后，加入MG132濃度10 μmol/L，孵育3 h。裂解細胞提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。鎳柱純化，收集洗脫液。BCA法測定洗液、洗脫液各組分蛋白濃度，加入5×SDS上樣緩沖液100℃，處理5 min；每孔上樣100 μg，15 mA恒流SDS-PAGE電泳，電轉至PVDF膜，麗春紅染色5 min，預留目標蛋白所在范圍，剪膜水洗使得條帶消失。5%的脫脂牛奶+TBST室溫封閉1 h，加入一抗(六種抗體分別稀釋為1∶500；β-actin為1∶1 000)，4℃冰箱過夜，次日TBST漂洗10 min×3次，加入HRP標記的二抗(羊抗鼠1∶5 000，羊抗兔1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST漂洗10 min×3次，ECL化學發光顯影。

表1 目的基因的引物序列及產物大小

Tab.1 Primer sequence and product size of target gene

PrimerSequenceProductsizehHSPC238_FTGCCAAGACTGTGGTTGAGA95bphHSPC238_RCAAAAGACACACGGGGCACThActin_FGATGAGATTGGCATGGCTTT105bphActin_RGTCACCTTCACCGTTCCAGThUBB_FAGCCTTTCTTACGGCTATGAGG136bphUBB_RGTTGCGTCACTTATCACCCChMT2A_FAAAGAACGCGACTTCCACAA70bphMT2A_RAGGAATATAGCAAACGGTCACGhHMOX1_FCGAGCATAAATGTGACCGGC139bphHMOX1_RTGCTGTCGGGTTGCGGAhRPS27a_FTGTGAAATGCCCAGGATGCTA78bphRPS27a_RGAGCAGCCAACACACAAAACT

2 結果

2.1 過表達及干擾HSPC238對HEPG2細胞內HSPC238及目標蛋白的影響 HEPG2細胞過表達HSPC238及干擾HSPC238后，分別通過RT-PCR和WB檢測內源性HSPC238及目標蛋白的mRNA和蛋白表達水平。內源性HSPC238、RPS27、UBB、HMOX1在HEPG2細胞中表達量相對較高，MT2A的表達水平較低；外源性干擾HSPC238后HMOX1、MT2A、RPS27表達下調較明顯，外源性過表達HSPC238后MT2A、UBB、RPS27表達水平也隨之上調，見圖1。

2.2 過表達目標蛋白對穩定高表達HSPC238細胞株內目標蛋白的影響 分別轉染pcDNA3.1/HMOX-1/RPS27A/MT2A/UBB各實驗組于穩定高表達HSPC238細胞株，鎳柱純化目標蛋白，以HSPC238做免疫印跡，結果表明約20 kD左右有正確大小條帶，即HSPC238與各目的蛋白結合，另外以MG132(10 μmol/L)處理細胞，較未處理細胞組條帶增加，表明泛素化的目標蛋白在MG132抑制蛋白酶體活性后大量累積，見圖2。

2.3 過表達目標蛋白對穩定低表達HSPC238細胞株內目標蛋白的影響 分別轉染pcDNA3.1/HMOX-1/RPS27A/MT2A/UBB各實驗組于穩定低表達HSPC238細胞株，鎳柱純化目標蛋白，以HSPC238做免疫印跡，結果表明約20 kD有正確大小微弱條帶，另外以MG132(10 μmol/L)處理細胞，較未處理細胞組條帶增加，顯示被泛素化的蛋白累積增加，見圖3。

圖1 外源干擾或過表達HSPC238后HEPG2細胞株內HSPC238及目標蛋白的mRNA和蛋白表達變化的影響Fig.1 Effect on expression of mRNA and protein of HSPC238 and target proteins in HEPG2 cell lines after interference or over expression of HSPC238 exogenous

圖2 轉染過表達目標蛋白的質粒于高表達HSPC238的HEPG2細胞株內，MG132處理后，觀察目標蛋白的代謝變化Fig.2 Transfect overexpression plasmid of target proteins into HEPG2 cell lines which was high expression of HSPC238,after MG132 treatment,observe metabolic changes of target protein

圖3 轉染過表達目標蛋白的質粒于低表達HSPC238的HEPG2細胞株內，MG132處理后，觀察目標蛋白的表達變化Fig.3 Transfect overexpression plasmid of target proteins into HEPG2 cell lines which was low expression of HSPC238,after MG132 treatment,observe metabolic changes of target protein

3 討論

本課題組在前期研究中已經證實，HSPC238在體內外均可以抑制肝癌細胞的生長[1]，進一步通過酵母雙雜交、免疫共沉淀、pull-down等系列實驗篩選到與其相互作用的目標蛋白(HMOX-1、RPS27A、MT2A、UBB)[2]，在此研究基礎上，本實驗初步探討HSPC238對上述四種目標蛋的調節作用及其調節途徑。

為明確HSPC238及其目標蛋白的內源性表達水平，本研究檢測了HEPG2細胞株內HSPC238及目標蛋白的mRNA和蛋白表達水平，結果表明HSPC238、HMOX1、RPS27a、UBB在HEPG2細胞中的內源性表達量相對較高，而MT2A蛋白的內源性表達水平較低；有研究表明，在肝細胞肝癌組織中HMOX1表達水平較高[3]，而RPS27a、MT2A表達水平較低[4,5]，目前尚未見UBB蛋白在肝癌組織中的表達及其與肝癌關系的相關研究報道。

為初步探討HSPC238對目標蛋白是否存在調節作用，本研究分別將HSPC238的過表達及干擾載體轉染入HEPG2細胞株，結果發現，當HEPG2細胞株轉染HSPC238干擾載體后HMOX1、MT2A、RPS27a表達下調較明顯，而轉染HSPC238過表達載體后MT2A、UBB、RPS27a表達水平也隨之上調。表明HSPC238對目標蛋白存在某種調節作用。

為探討HSPC238對目標蛋白的調節機制，本研究分別將目標蛋白的高表達質粒轉染于穩定高(低)表達HSPC238的細胞株，鎳柱純化目標蛋白，以HSPC238做免疫印跡，均有目標條帶出現，表明HSPC238與目標蛋白存在結合。再以蛋白酶體抑制劑MG132處理細胞，繼續培養一段時間后進一步裂解細胞做免疫印跡，結果表明，MG132處理組與未處理細胞組比較，條帶明顯增加，表明被泛素化的蛋白累積增加，即目標蛋白通過UPP途徑代謝。

UPP途徑是體內多數蛋白質的代謝通路，主要降解胞內蛋白，我們的前期研究已經證實目標蛋白均存在于胞質中[6,7]，而又有學者研究發現HSPC238蛋白具有E3酶活性，且HMOX1、RPS27a、UBB、MT2A四種目標蛋白均與腫瘤存在密切關系[8-16]。因此我們推測HSPC238蛋白扮演E3角色通過UPP途徑來調節目標蛋白的代謝，其具體代謝及調節作用機制，有待進一步研究證實。

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[收稿2015-10-01 修回2015-11-05]

(編輯 張曉舟)

A preliminary study on regulation of HMOX1,RPS27a,MT2A and UBB by HSPC238

TAN Jia-Yu，HUANG Xiang，CHEN Jing-Lin，ZHONG Yu-Heng.The Third Clinical College of Southern Medical University,Boai Hospital Affiliated to Southern Medical University ,Zhongshan 528403,China

Objective:To investigate the effect of HSPC238 overexpression or low expression on the regulation of the target protein (HMOX1，MT2A，UBB，RPS27a) and the regulation pathways.Methods: To construct the interference vector and overexpression vector of HSPC238 respectively，transfected the HEPG2 cell lines by the liposome method，detect the expression of mRNA and protein of the HSPC238 and the target proteins by the RT-PCR and Western blot，further to transfer the overexpression plasmids of the target proteins into the HEPG2 cell lines which had been transfected with interference vector and overexpression vector of HSPC238，the experimental group cell lines were treated with proteasome inhibitor MG132，to purify the target proteins with nickel column，do immunoblotting with HSPC238 to detect the accumulation situation of the target proteins.Results: The HMOX1,MT2A,RPS27a were downregulated obviously when the HSPC238 was interfered exogenous;and the MT2A,UBB,RPS27a were up-regulated after the HSPC238 overexpressed.The overexpression plasmid of target proteins were transfected into the HEPG2 cell lines which have been transfected with interference vector and overexpression vector of HSPC238，compared with the control group,the target protein band in the experimental group was significantly increased after treatment with the proteasome inhibitor MG132.Conclusion: The HSPC238 overexpression can upregulate the expression of MT2A,UBB and RPS27a,and interfering HSPC238 can downregulate the expression of HMOX1,MT2A and RPS27a;the HSPC238 target protein may play a regulatory role through the UPP pathway；the HSPC238 may play a regulatory role on the target proteins through the UPP pathway.

HSPC238；Ubiquitin-proteasome pathway；Target protein

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.013

①本文受國家自然科學基金(81101534)、廣東省自然科學基金(S2012010010824)和廣東省醫學科研基金(A2013875)項目資助。

譚家余(1969年-)，男，博士，主要從事腫瘤免疫學相關研究，E-mail：842630809@qq.com。

及指導教師：黃 湘(1971年-)，女，博士，主任技師，碩士生導師，主要從事腫瘤免疫學相關研究，E-mail：340382761@qq.com。

R392.1

A

1000-484X(2016)04-0509-04