T-exo 負載DC誘導抗肝癌細胞免疫效應研究①

李潔羽 陳明水 陳淑萍 周智鋒 王 玲 葉韻斌

(福建省腫瘤醫院腫瘤免疫學研究室，福建省腫瘤轉化醫學重點實驗室，福州350014)

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T-exo 負載DC誘導抗肝癌細胞免疫效應研究①

李潔羽 陳明水 陳淑萍 周智鋒 王 玲 葉韻斌

(福建省腫瘤醫院腫瘤免疫學研究室，福建省腫瘤轉化醫學重點實驗室，福州350014)

目的：觀察肝癌細胞來源的外泌體(T-exo)負載DC體外誘導細胞毒T細胞(CTL)對肝癌細胞的殺傷作用。方法：采用超濾離心技術聯合蔗糖密度梯度超速離心的方法從肝癌Huh-7細胞培養上清液中分離外泌體(T-exo),透射電鏡鑒定形態，Western blot 檢測外泌體相關蛋白CD9、CD63、HSP70及腫瘤抗原分子AFP的表達；分離健康供者外周血單個核細胞(PBMC)培養DC,流式細胞術鑒定負載T-exo 的DC細胞表型；用2-(4-碘苯)-3-(4硝基苯)-5-(2,4-磺苯基四氮唑)-2H-四唑單鈉鹽-1(WST-1)法檢測負載T-exo 的DC 刺激 T淋巴細胞增殖情況；流式細胞術Annexin-V/PI雙染法檢測負載T-exo 的DC誘導CTL分別對AFP陽性Huh-7細胞及AFP陰性的SMMC7721細胞的殺傷作用。結果：透射電鏡下可見T-exo為圓形或橢圓形雙層膜囊泡狀小體，大小不等，平均直徑50～100 nm，表達外泌體膜相關分子及腫瘤抗原分子。負載T-exo 的DC 可促進初始T細胞增殖，T-exo致敏DC對AFP陽性的Huh-7肝癌細胞系殺傷活性明顯高于AFP陰性的SMMC7721肝癌細胞組(P<0.05)及未負載T-exo 的對照組DC(P<0.05)。結論：負載T-exo 的DC 能促進 T細胞增殖，提高CTL細胞的細胞毒活性誘導特異性的抗肝癌效應。經T-exo抗原致敏DC誘導的CTL對肝癌細胞有明顯的細胞毒作用，明顯高于DC對照組(P<0.05)。

樹突狀細胞；外泌體；肝癌；細胞毒T細胞

外泌體(Exosome)[1]是由多種活細胞分泌的，直徑在50～100 nm，具有脂質雙層結構的納米級的囊泡小體，由細胞內多囊泡體(Multivesicular bodies,MVBs)的界膜向腔內出芽而成，經MVBs 與質膜直接融合后釋出胞外。外泌體含有大量與其來源和功能密切相關的蛋白質、脂質及RNA成分，能介導細胞間物質和信息傳遞[2]。研究發現腫瘤細胞分泌的Exosomes(T-exo)可調節腫瘤微環境，介導腫瘤遺傳物質轉運而促進腫瘤侵襲轉移[3]。此外，T-exo上也表達腫瘤細胞同源的共同和特異性抗原、跨膜分子CD63、細胞靶向相關分子CD9和腫瘤抗原運載蛋白HSPs等，能將腫瘤抗原轉移到APC或直接刺激誘導CD8+T 細胞介導的抗腫瘤免疫應答，提示T-exo可作為一種新型的非細胞結構腫瘤疫苗。目前，Exosomes已應用于免疫研究及少數腫瘤的臨床治療研究，在法國Institut Gustave Roussy和美國Duck大學進行的晚期黑色素瘤和非小細胞肺癌患者Ⅰ、Ⅱ期臨床治療中，其穩定病情的作用及安全性得到證實[4]。本研究從肝癌Huh-7細胞提取T-exo，體外刺激樹突狀細胞，探討攜帶AFP抗原的T-exo負載DC制備的DC疫苗的生物學功能以及誘導細胞毒T細胞對肝癌細胞的殺傷作用，為進一步研究新型DC疫苗應用于腫瘤免疫治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 肝癌細胞株Huh-7和SMMC7721為本實驗室保存。細胞培養液RPMI1640、DMEM購自Gibco Invitrogen公司，IL-4、GM-CSF、LPS及胎牛血清(FBS)購自PeproTech公司，重水、分析純蔗糖購自Sigma 公司，超速離心管購自美國Beckman 公司，0.22 μm濾膜購自美國Millipore公司。 Annexin-V/PI購自美國BD公司，淋巴細胞分離液(Ficoll 1.077 g/ml)購自天津血研所，一抗(鼠抗AFP、CD9、CD63、HSP70單抗)購自Abcam公司。2-(4-碘苯)-3-(4硝基苯)-5-(2,4-磺苯基四氮唑)-2H-四唑單鈉鹽-1[2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazo-lium,monosodium salt,WST-1]檢測試劑盒均購自Promega公司，超高速低溫離心機購自美國Beckman 公司，流式細胞儀FACS CantoⅡ購自美國BD公司，透射電鏡購自日立公司，酶標儀購自Thermos公司 。

1.2 方法

1.2.1 腫瘤細胞外泌體(Tumor exosome，T-exo)的制備 將胎牛血清加入到普通離心管中，4℃、8 819 r/min離心30 min ，取上清液，用Beckman 專用超速離心管中，4℃ 24 100 r/min超速離心1 h，取上清液，即為去除Exosomes的胎牛血清。 Huh-7細胞加入DMEM、10% 胎牛血清(已去除內在Exosomes)培養48 h后收集細胞培養上清液，4 ℃ 1 528 r/min離心10 min去除細胞，2 494 r/min低溫離心30 min去除細胞碎片，8 819 r/min低溫離心30 min取上清液，用離心超濾管，以2 789 r/min離心30 min濃縮，并將30 g/L的蔗糖重水、濃縮液和PBS以約3∶3∶4的比例依次加入離心管中，以 24 100 r/min，4℃超速離心60 min。取出承載Exo的蔗糖/重水緩沖墊，置于100 kD MWCO超濾離心管中2 789 r/min離心30 min，用PBS洗滌后得到的T-exo，0.22 μm濾膜過濾除菌，采用BCA法定量T-exo的總蛋白，-80℃保存備用。

1.2.2 透射電鏡觀察T-exo 形態 取20 μl T-exo懸液滴于電鏡專用載樣銅網上，室溫靜置1 min，滴加2% pH7.0磷鎢酸溶液，室溫靜置負染1 min，白熾燈下烤干后，透射電鏡下觀察拍照。

1.2.3 Western blot檢測T-exo中CD63、CD9、HSP70、AFP蛋白的表達及DC攝取T-exo后肝癌抗原AFP分子的表達 提取Huh-7細胞的總蛋白及經超聲波沖擊破膜后的Huh-7細胞來源的Exosomes，采用BCA法測定蛋白濃度，分別取30 μg經10 % SDS-PAGE電泳分離，濕轉至PVDF膜，3%BSA室溫封閉1 h，分別加入一抗CD63、CD9、HSP70及AFP(鼠源性，均按1∶1 000稀釋)和β-Actin(1∶3 000)，4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠或山羊抗兔IgG (1∶5 000)，室溫孵育2 h，充分洗膜后加入ECL化學發光試劑暗室顯影。同時收集對照組DC細胞和T-exo抗原負載組DC細胞，BCA法測定蛋白濃度后，檢測AFP的表達水平(按照試劑盒方法操作)。采用Image Lab 4.1凝膠圖像分析軟件分析灰度。以目的蛋白條帶與β-Actin條帶灰度值比值表示各目的蛋白表達水平。

1.2.4 DC細胞的分離和培養 常規抽取健康志愿者肝素抗凝外周血50 ml，淋巴細胞分離液Ficoll分離外周血單個核細胞，細胞密度調整為4×106ml-1，置于37℃、5%CO2培養箱孵育2 h，貼壁的DC前體細胞，加入含rhGM-CSF 100 ng/ml和rhIL-4 50 ng/ml的RPMI1640完全培養基，第 3天換液,加入T-exo抗原并補充相應的細胞因子，第6天加入10 μg/ml LPS,置培養箱中繼續培養過夜，次日收獲DC細胞。

1.2.5 流式細胞術檢測負載T-exo 的DC表型 收集培養到第7天的DC細胞，分別加入CD83、CD209(ICAM-3)、CD1a、CD80、CD86、 HLA-DR 熒光標記抗體或相應的同型對照抗體，混勻后室溫避光孵育30 min，PBS緩沖液洗滌后，用FACS Canto II(BD Biosciences)流式細胞儀檢測，BD FACSDivaTMsofeware軟件進行DC細胞表型的數據分析。

1.2.6 肝癌細胞體外培養 以DMEM+10% FBS 培養液將凍存的肝癌細胞株Huh-7、SMMC7721復蘇，于37℃、5%CO2培養箱中培養，細胞生長狀態良好，細胞平鋪培養瓶底融合度達80% 時進行傳代培養，以備后續實驗。

1.2.7 CTL細胞的誘導 將誘導至第8天的T-exo負載的DC疫苗和未經肝癌抗原致敏的對照組DC作為刺激細胞，調整細胞濃度為1×105ml-1，加入絲裂霉素C 25 μg/ml，37℃孵育45 min，PBS洗3次，完全培養基懸浮。常規密度梯度離心分離PBMC，置37℃、5%CO2培養箱孵育2 h，收集非貼壁細胞，進行CD3+T淋巴細胞的磁珠分選，調整CD3+T(簡稱初始T淋巴細胞)濃度為1×106ml-1，DC細胞與T細胞按1∶10 的比例混合，置37℃、5%CO2培養箱共孵育48 h。

1.2.8 DC誘導初始T淋巴細胞的增殖效應 采用WST法測定細胞增殖活性，WST-1是一種四唑鹽，能被活細胞線粒體內脫氫酶還原生成橙黃色的可溶性甲瓚，甲瓚產生的水平和代謝活性細胞數量成正比，將結晶融解后，根據吸光度(A)值計算細胞增殖情況。取上述各刺激組的淋巴細胞，充分混勻后，調密度1×105ml-1，各吸取100 μl/孔于96孔細胞培養板中，每組設三個復孔，37℃、5%CO2、100%濕度條件下孵育24 h后，每孔分別加入10 μl WST-1試劑，混勻后，繼續孵育4 h。用酶標儀測定波長450nm下樣品的吸光值。

1.2.9 Annexin-V/PI雙染法檢測T-exo-DC誘導CTL對肝癌細胞的殺傷效應 將Huh-7和SMMC7721作為靶細胞，調整靶細胞密度至1×106ml-1，分別收集效應細胞1 764 r/min離心5 min，調整效應細胞密度至5×106個/ml。效/靶細胞25∶1混合，37℃、5% CO2條件下孵育4 h 。1 764 r/min離心5 min吸棄上清，預冷的1×PBS 清洗一遍，將細胞重懸于500 μl binding buffer，分別加入CD3-APC、 Annexin-V-FITC置于4℃孵育30 min，以預冷binding buffer洗滌后，上機前 Propidium Iodide染色10 min，不用洗滌，直接上流式細胞儀檢測。CTL細胞殺傷率(%)=(APC-細胞-APC-FITC-PI-細胞)/(APC-細胞)×100。

圖1 Huh-7細胞來源的exosomes電鏡結構(×150 000)Fig.1 Electron micrograph of Exosome derived from Huh-7 cells(×150 000)

2 結果

2.1T-exo的形態觀察Huh-7細胞培養上清經蔗糖密度梯度超速離心獲得的T-exo，透射電鏡觀察形態(圖1)顯示，T-exo為直徑介于30～100nm的膜性微囊，呈圓形或橢圓形，散在分布或聚集成團，腔內為低電子密度成分。

2.2Westernblot通過Westernblot法檢測T-exo中CD63、CD9、HSP70及肝癌抗原AFP蛋白的表達水平，檢測結果(圖2)顯示T-exo表達來源Huh-7細胞的相關分子：跨膜分子CD63、細胞靶向相關分子CD9、腫瘤抗原運載蛋白HSP70及AFP抗原分子。同時，與對照組DC細胞相比，T-exo負載的DC細胞高表達肝癌抗原AFP蛋白，說明DC細胞攝取了攜帶抗原物質的外泌體。

圖2 CD63、CD9、HSP70(A)和AFP(A、B)表達水平Fig.2 Expression of CD63，CD9，HSP70(A) and AFP(A，B) detected by Western blot

圖3 未成熟樹突狀細胞(A)和成熟樹突狀細胞(B)的形態(×40)Fig.3 Morphology of imDC(A) and mDC(B)(×40)

圖5 T-exo負載DC對T淋巴細胞增殖的影響Fig.5 Effect of lymphocyte proliferation induced by DC-T-exo

2.3T-exo負載的DC表型分析rhIL-4、rhGM-CSF誘導DC分化增殖，T-exo抗原負載DC后第6天加入LPS,培養24h后高倍鏡下可見細胞大部分呈懸浮生長，體積增大，細胞邊緣有毛刺樣突起，呈現典型的樹突狀細胞形態，聚集成簇呈集落狀態(圖3A、B)。經LPS刺激后的DC表面分子CD83、CD209(ICAM-3)、CD1a、CD80、CD86、HLA-DR的表達分別為(70.59±2.89%)、(80.51%±2.86%)、(33.48%±2.80%)、(58.11%±2.68%)、(77.84%±4.75%)、(94.55%±1.48%)與未成熟DC的(30.33%±5.65%)、(80.59%±3.49%)、(13.15%±4.25%)、(25.39%±4.53%)、(36.74%±4.08%)、(89.65%±4.12%)相比，CD83、CD1a、CD80、CD86的表達率明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)(圖4A、B)。

2.4 負載T-exo的DC對初始T淋巴細胞增殖的影響T-exo負載的DC與對照組DC分別與初始T細胞(1∶10)共孵育48h，取刺激組及對照組T細胞，按照細胞增殖檢測試劑WST-1操作說明，測定各組吸光度(A)值，結果(圖5)顯示，DC疫苗可誘導強烈的增殖反應，T-exo抗原負載DC組誘導初始T細胞增殖測得的吸光(A)值為(1.472±0.067)顯著高于單純淋巴細胞組(0.390±0.074)(P<0.05)和無抗原負載DC組(0.906±0.020)(P<0.05)。

圖6 T-exo-DC誘導的CTL對Huh-7和SMMC7721肝癌細胞的殺傷Fig.6 Cytotoxic effect of CTLs induced by DC-Texo against Huh-7 and SMMC7721 cells

2.5T-exo負載的DC體外誘導CTL對肝癌細胞株的殺傷效應 在效靶比為25∶1條件下各組CTL分別與Huh-7 及SMMC7721肝癌細胞株共培養4h后，流式細胞術檢測Annexin-V/PI雙標記細胞百分比，結果(圖6)顯示，經T-exo抗原致敏DC誘導的CTL對肝癌細胞有明顯的細胞毒作用，明顯高于DC對照組(P<0.05)。T-exo致敏DC組對AFP陽性的Huh-7肝癌細胞系有顯著的殺傷作用，殺傷率(68.3±3.34)% 明顯高于AFP陰性的SMMC7721肝癌細胞組(36.3±5.29)%(P<0.05)。

3 討論

肝癌是我國高發的惡性腫瘤之一，目前治療手段主要包括手術、肝動脈化療栓塞術(TACE)、射頻消融、分子靶向等[5]。但是，患者由于術后復發，化療藥物的耐藥及毒副作用使肝癌的治療效果仍不理想。基于樹突狀細胞(Dendriticcell，DC)的免疫治療能夠誘導針對腫瘤抗原的特異性殺傷的細胞毒T細胞(CytotoxicTlymphocyte,CTL)，使其成為腫瘤免疫治療的主要策略之一[6]。甲胎蛋白(Alphafetoprotein，AFP)是肝癌較為特異的標志物，大約2/3的肝癌患者血清高表達AFP，故其成為肝癌免疫治療的潛在靶點。T-exo指腫瘤細胞來源的外泌體，作為一種新型亞細胞腫瘤疫苗，成為近年來疫苗研究的熱點。蛋白組學分析顯示，T-exo表達MHCⅠ類分子、四跨膜蛋白、熱休克蛋白及腫瘤相關抗原等[7]，成分簡單，免疫原性強，既避免了腫瘤細胞裂解物成分的復雜性，又克服于腫瘤抗原肽半衰期短、轉導效率低的不足，T-exo作為腫瘤疫苗，被樹突狀細胞攝取后，可激活T淋巴細胞，誘導機體特異性的抗腫瘤免疫效應[8,9]。

本實驗中采用蔗糖密度梯度超速離心的方法從Huh-7肝癌細胞培養上清中提取Exosomes，電鏡下觀察呈圓形或橢圓形，直徑介于50～100nm的膜性微囊，表達跨膜分子CD63、細胞靶向分子CD9、腫瘤抗原運載蛋白HSPs，同時攜帶有肝癌相關抗原AFP。用rhIL-4和rhGM-CSF聯合培養外周血來源的DC，使其負載Huh-7肝癌細胞來源的T-exo，經LPS誘導成熟，顯微鏡下可觀察到典型的樹突狀細胞形態，流式細胞術測定DC細胞高表達CD83、CD209(ICAM-3)、CD1a、CD80、CD86、HLA-DR分子。T-exo負載的DC細胞高表達肝癌抗原AFP蛋白，說明DC細胞攝取了攜帶腫瘤抗原物質的T-exo。功能性的DC可刺激初始T淋巴細胞的增殖并產生CTL細胞，誘導生成的CTL對AFP陽性Huh-7細胞具有明顯的殺傷活性，對于AFP陰性的SMMC7721也可發揮一定的殺傷效應，且殺傷率要顯著高于無抗原負載的DC組。實驗結果說明T-exo可作為較好的腫瘤疫苗，啟動免疫效應細胞介導的抗腫瘤免疫。

腫瘤細胞來源Exosome上表達腫瘤共同和特異性抗原，細胞靶向和腫瘤抗原運載分子等，含有多種腫瘤的共同抗原，通過特異的受體或配體被DC攝取，經MHC分子交叉呈遞并激活T細胞，從而發揮殺瘤效應[10]。T-exo充當腫瘤抗原的采集和運輸載體，用其制備的DC疫苗可用于一種甚至多種腫瘤的免疫治療和預防[11]。本研究成功地從肝癌細胞分離出T-exo，并證實了肝癌細胞來源的T-exo可誘導CTL反應，增強抗腫瘤免疫效應，為肝癌的免疫治療提供新的治療方法。Exosome盡管在動物和人的研究中都取得了很大進展，但也有研究發現T-exo除了可通過DC刺激抗腫瘤免疫應答外，在一定條件下可以誘導免疫耐受[12]。如今越來越多的研究者們開始致力于如何提高T-exo作為疫苗的療效和安全性，同時降低其對腫瘤免疫的負向調節，這對闡明其生物學功能及在腫瘤免疫治療中的應用具有重要意義。

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[收稿2015-10-08 修回2015-11-06]

(編輯 倪 鵬)

Cytotoxic effects against hepatoma cells by DCs loaded with exosome derived from Huh-7 cells

LI Jie-Yu,CHEN Ming-Shui,CHEN Shu-Ping,ZHOU Zhi-Feng,WANG Ling,YE Yun-Bin.Immunology Laboratory of Fujian Provincial Cancer Hospital，Fujian Key Laboratory of Translational Cancer Medicine,Fuzhou 350014,China

Objective:To investigate the cytotoxic effects of CTL cell induced by DCs loaded with exosomes derived from hepatoma Huh-7 cells(T-exo).Methods: Exosomes derived from hepatoma Huh-7 cells were isolated and purified by combination of ultrafiltration centrifugation and sucrose density gradient centrifugation.Morphology of exosomes was observed under transmission electron microscopy and the expression of CD9,CD63,HSP70 and AFP was detected by Western blot.DCs were induced with peripheral blood monocytes isolated from healthy donors.Flow cytometry was used to analysis surface markers of the DCs loaded with T-exo.WST-1 light absorption measurement was adopted to evaluate the T cell proliferation ability.Annexin-V/PI Flow cytometry were respectively used to examined cytotoxicity against the tumor cells.Results: Exosomes isolated and extracted from culture supernatant of Huh-7 cells presented as circular or elliptical vesicle with bilayer membrane,unequal in size,and with diameter of 50 to 100 nm.Western blot showed that the T-exo expressed CD9，CD63，HSP70 and AFP molecules.DCs loaded with T-exo caused significantly higher T cell proliferation and cytotoxic effect against AFP positive Huh-7 cells as compare to gainst AFP negative SMMC7721 cells and un-loaded control group(P<0.05).Conclusion: T-exosome loaded-DC can promote proliferation and induce significant cytotoxic effect of CTL against Huh-7 cells.

Dendritic cells(DC);Exosome;Liver cancer;Cytotoxic T cells

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.015

①本文受廈門大學藥學院-福建省腫瘤醫院促進科技合作聯合研究基金(No.2014LY-2L-04)和國家臨床重點?？平ㄔO項目資助。

李潔羽(1975年-)，女，碩士，主要從事腫瘤免疫學研究，E-mail：2013ljy@sina.com。

及指導教師：葉韻斌(1964年-),女，博士，教授，碩士生導師，主要從事腫瘤免疫學方面研究，E-mail：zjyunbin@189.cn。

R392.12

A

1000-484X(2016)04-0519-05