狼瘡性腎炎患者外周血樹突狀細胞功能的研究

譚德敏 向 陽 譚千林

(湖北民族學院附屬民大醫院,恩施445000)

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狼瘡性腎炎患者外周血樹突狀細胞功能的研究

譚德敏 向 陽 譚千林

(湖北民族學院附屬民大醫院,恩施445000)

目的： 體外培養狼瘡性腎炎患者外周血樹突狀細胞，并從細胞的表型和功能方面觀察與對照組樹突狀細胞的不同，從而探討樹突狀細胞在狼瘡性腎炎疾病的發病機理。方法：選取50例健康對照者與50例狼瘡性腎炎患者，收集狼瘡性腎炎患者 及健康對照組的外周血 ，體外給予10 ng/ml GM-CSF及IL-4的血清培養液培養，并在第7天，收集細胞及上清，運用流式細胞技術檢測DCs表型表達，ELISA方法檢測細胞上清TNF-α、 IL-12含量變化，檢測樹突狀細胞刺激淋巴細胞增殖的能力。結果：與對照組相比，狼瘡性腎炎患者外周血樹突狀細胞表面表達的CD80、CD86、CD40及MHCⅡ數量明顯高于對照組，差異存在統計學意義(P<0.05)；樹突狀細胞分泌的TNF-α、 IL-12明顯高于對照組，差異存在統計學意義(P<0.05)；樹突狀細胞刺激淋巴細胞增值反應能力明顯高于對照組，差異存在統計學意義(P<0.05)。結論：相比于健康對照組，狼瘡性腎炎患者外周血樹突狀細胞呈現較成熟的狀態，提示樹突狀細胞與狼瘡性腎炎疾病具有很大的相關性。

樹突狀細胞；狼瘡性腎炎；成熟

狼瘡性腎炎(Lupus nephritis，LN)是一種多種因素導致的復雜性疾病，其致病機制至今未明，但多種研究認為其與免疫因素密切相關[1]。樹突狀細胞(Dendritic cells,DCs)作為機體內最重要的抗原遞呈細胞，在機體起著重要作用。成熟的樹突狀細胞可以高表達多種共刺激因子，如CD86、CD80、CD40、MHCⅡ等，高分泌多種細胞因子，如IL-12、TNF-γ，誘導幼稚的T細胞分化成熟，促進T細胞向Th1/Th2極化，從而激活免疫應答[2-4]。鑒于DCs在免疫系統中的重要作用，我們推測DCs在LN患者的發病機制中起到了重要的作用。因此，本研究提取LN患者的外周血，分離純化得到DCs，觀察DCs的表型和功能的變化，來探討DCs在LN疾病發生發展的意義。

1 對象與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料 (1)實驗組：選取2013年1月到2015年6月在我院腎內科就診的LN患者50例，其中男性30例，女性20例，年齡為27～64歲，平均(37.9±7.6)歲。納入標準：①病情符合1982年美國風濕病學會修訂的LN診斷標準，并經腎活檢病理檢查確診為LN的患者；②患者年齡在75歲以下，心肝功能基本正常。排除標準：①患者自身存在風濕性關節炎、系統性血管炎等其他風濕性免疫性疾病，病毒性肝炎、心梗、糖尿病等影響免疫系統的疾病；②入院前3個月內使用過激素或免疫性藥物的患者；③妊娠及哺乳期婦女；④合并有心腦造血系統及精神系統的患者。⑵對照組：選取健康志愿者50例，其中男性28例，女性22例，年齡為26～67，平均(38.2±6.5)歲。納入標準：①不存在LN的臨床癥狀，并且影像學檢查未見異常；②患者年齡在75歲以下，心肝功能基本正常。排除標準同實驗組。實驗組與對照組在性別、年齡等方面差異不存在統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本調查程序符合本單位的倫理學標準并得到批準，且已得到患者與家屬的知情同意。

1.1.2 標本采集 分別收集對照組及實驗組在血液標本8 ml，肝素抗凝。

1.2 方法

1.2.1 DCs的分離培養 將血液標本與PBS緩沖液倍比稀釋混勻，嚴格按照說明書進行步驟操作，將混合液輕輕置于淋巴細胞分離液上，4℃，3 000 r/min，離心30 min。輕輕取出離心管，此時會出現分層，將第二層白膜細胞洗出置于另一離心管中，加入PBS清洗，獲得單個核細胞備用。配置含有10%胎牛血清的1640培養基，并加入GM-CSF及IL-4細胞因子(均購于Peprotech公司)，終濃度均為10 ng/ml。將獲得的單個核細胞用上述聯合培養基重懸，于6孔板中培養，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。48 h后全量換液，棄去漂浮的細胞，并再加入上述聯合培養基繼續培養，隔天進行半量換液。繼續培養至第7天，收集細胞及上清用于實驗檢測。

1.2.2 流式細胞儀檢測細胞表型 收集培養第7天的細胞，與用異硫氰酸酯(FITC)或藻紅沅素(PE)標記的流式抗體CD80、CD86、CD40及MHCⅡ(均購于eBioscience公司)混合，4℃孵育30 min，PBS洗滌2次后，每管加入300 μl的PBS溶液重懸后，上流式細胞儀進行檢測，記錄結果為陽性細胞所占的比例。

1.2.3 細胞因子檢測 收集培養第7天的細胞上清，嚴格按照試劑盒說明書，應用TNF-α、 IL-12 酶聯免疫試劑盒(均購于eBioscience公司)，檢測上清細胞因子含量。

1.2.4 同種混合淋巴細胞反應 取健康志愿者外周血10 ml，經過淋巴細胞分離液梯度離心后獲取單個核細胞，PBS洗滌后，于培養皿中培養，置于37℃、5%CO2培養箱中，24 h后收集懸浮細胞，視其為淋巴細胞。將收集培養第7天的DCs用絲裂霉素C 25 μg/ml，處理 45 min后用PBS洗滌收集細胞，用10%胎牛血清的1640培養基重懸，調整細胞濃度為1×106ml-1，取100 μl置于96孔板中。并將淋巴細胞也用10%胎牛血清的1640培養基重懸，調整細胞濃度為1×106ml-1，也取100 μl置于96孔板中，使DCs與淋巴細胞混合的最終容積為200 μl，然后置于37℃、5%CO2培養箱培養72 h。于培養結束時向每孔加入20 μl的MTS/PMS混合液，培養3 h后，應用光密度儀進行光密度檢測，以OD值來反應淋巴細胞增殖程度。

2 結果

2.1 各組對象外周血DCs表面共刺激分子表達LN患者與對照組相比，外周血DCs表面表達的CD80、CD86、CD40及MHCⅡ明顯高于對照組，各組均存在統計學意義(P<0.05)，具體見表1。

2.2 各組對象外周血DCs細胞因子分泌LN患者與對照組相比，外周血DCs分泌的TNF-α、IL-12明顯高于對照組，各組均存在統計學意義(P<0.05)，具體見表2。

2.3 各組對象外周血DCs刺激淋巴細胞增殖反應LN組和對照組IL-12含量分為2.6±0.5、1.2±0.6，可見LN患者外周血DCs刺激淋巴細胞增殖反應能力明顯高于對照組，各組均存在統計學意義(P<0.05)。

GroupsCD80CD86CD40MHCⅡLNgroup61.3±5.91)90.2±6.91)52.9±5.81)85.6±5.11)Normalcontrolgroup50.3±5.680.6±6.146.2±6.575.9±4.9

Note：Vs normal control group,1)P<0.05.

GroupsIL-12TNF-αLNgroup210.6±11.21)321.6±15.21)Normalcontrolgroup150.6±10.6150.8±14.9

Note：Vs normal control group,1)P<0.05.

3 討論

LN作為一種嚴重危害人類健康的自身免疫性疾病，多種致病因素均可誘導其發病，其確切病因至今未明，但多種研究認為四大因素是LN的主要發病因素：①遺傳缺陷：研究發現LN發病具有家族聚集性，存在多種易感基因，其發生補體基因缺陷的頻率較高，存在較多的凋亡基因及免疫球蛋白受體基因，均可導致疾病的發生發展；②環境因素：其中紫外線、化學損傷，如含鉛苯的化學試劑，可疑刺激因素，如感染和飲食等；③性激素異常：均可導致免疫功能紊亂，從而影響LN發病；④免疫因素：多種細胞因子、生長因子及自身抗體都參與了疾病的進展[5-7]，多項研究表明Th1/Th2細胞的極化在LN發病過程中起著重要作用。

DCs起源于骨髓造血干細胞，為目前已知的功能最強的專職抗原提呈細胞(Antigen Presenting Cells，APC)，具有獨特的刺激 na?ve T 細胞活化的能力，是連接固有免疫和適應性免疫的“橋梁”。近年來，隨著 DCs 生物學特性和功能的深入研究，發現DCs 的成熟狀態是決定其有效呈遞抗原的關鍵因素，會直接影響免疫應答的反應，從而影響機體的各種生命活動[8,9]。正常機體絕大多數DCs處于未成熟狀態，多位于實體器官及非淋巴組織的上皮，具有較強的抗原攝取能力，但抗原遞呈及表達協同刺激分子能力較弱。未成熟DCs攝取抗原后，遷移到引流淋巴結，逐漸發育成熟，成為成熟DCs，高表達MHC類分子及CD80、CD86、CD40等共刺激分子，分泌IL-12、TNF-α等炎性細胞因子，激活T細胞應答，誘導免疫反應[10]。然而，樹突狀細胞也可以分泌抗炎性細胞因子，如IL-10，可通過誘導免疫耐受，或是促進Th2細胞分化來影響免疫反應[11]。

本研究可以看出，與健康對照組相比，LN患者外周血DCs表面表達的共刺激分子CD80、CD86、CD40及MHCⅡ數量明顯升高(P<0.05)；DCs分泌的TNF-α、 IL-12致炎性因子明顯升高(P<0.05)；DCs刺激淋巴細胞增值反應能力明顯升高(P<0.05)。即與健康對照組相比，LN患者外周血DCs呈現較成熟的狀態，可誘導淋巴細胞增值，推測其在調節 Th1/Th2平衡中可能起到重要作用，但仍需進一步研究探討。

綜上所述，相對于健康對照者，LN患者外周血DCs呈現一種較成熟的狀態，即DCs參與了LN疾病的發生與發展，并在其中起著重要作用，因此臨床可開展針對DCs的干預來治療或改善LN的病程。

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[收稿2015-07-09 修回2015-07-21]

(編輯 許四平)

Study on immune function of blood dendritic cells in patients with lupus nephritis

TAN De-Min,XIANG Yang,TAN Qian-Lin.University Hospital of Hubei University for Nationalities,Enshi 445000,China

Objective:To investigate the different function of dendritic cells between patients with lupus nephritis and healthy control,and discuss the pathogenesis of the disease.Methods: Choose 50 healthy controls,50 patients with lupus nephritis,and isolation of blood dendritic cells. Then samples were induced with GM-CSF and IL-4,and cells were collected on day 7. DC maturity was evaluated using the following methods:fluorescence-activated cell sorting analysis for cell surface markers;enzyme-linked immunosorbent assay for cytokine production;cell proliferation assay for induction of T cell proliferation.Results: Compared with the control group,lupus nephritis group had increased MHC Ⅱ,CD86,CD80,and CD40 expression(P<0.05);displayed the increased IL-12 and TNF-α levels(P<0.05);displayed a increased ability to drive lymphocyte cells proliferation(P<0.05).Conclusion: Compared with the control group,dendritic cells in lupus nephritis group displayed the mature condition,which indicates that dendritic cells play the important role in the pathogenesis of lupus nephritis.

Dendritic cells;Lupus nephritis;Maturation

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.027

譚德敏(1980年-)，男，在讀碩士，主要從事風濕腎病方面的研究，E-mail：tanminde_22@163.com。

R593.242

A

1000-484X(2016)04-0570-03