Fli-1及其靶基因在顱內動脈瘤患者中的表達

魏 亮, 楊 成, 張燕飛, 王 琦, 管宏新, 孫志揚

(同濟大學附屬上海市東方醫院神經外科，上海 200120；*通訊作者，E-mail: dfsunzy@126.com)

?

Fli-1及其靶基因在顱內動脈瘤患者中的表達

魏 亮, 楊 成, 張燕飛, 王 琦, 管宏新, 孫志揚*

(同濟大學附屬上海市東方醫院神經外科，上海 200120；*通訊作者，E-mail: dfsunzy@126.com)

目的 探討Fli-1及其靶基因COL1A1、TNC在顱內動脈瘤患者血液單核細胞中的表達及作用。 方法 研究納入41例顱內動脈瘤患者，其中25例動脈瘤破裂患者，16例動脈瘤未破裂患者；取病人的外周血，10例正常人外周血作為對照，分離血液單核細胞，提取總RNA，根據之前生物信息預測結果，采用實時定量RT-PCR檢測Fli-1及其靶基因(COL1A1、TNC) 在疾病和健康人群中的表達差異。 結果 在檢測的Fli-1及靶基因COL1A1和TNC中，在顱內動脈瘤中差異表達的基因有2個，分別為Fli-1和COL1A1。進一步分組發現，相比于未發生破裂的動脈瘤患者，這兩個基因在破裂的顱內動脈瘤患者中的表達有顯著升高。 結論 破裂與未破裂顱內動脈瘤患者之間Fli-1及COL1A1的表達水平差異可能與動脈瘤的破裂表現存在相關性。

顱內動脈瘤； 差異表達基因； Fli-1， COL1A1

顱內動脈瘤(intracranial aneurysm)是一種常見的多因素疾病，在全球范圍內其發生率為3.2%[1]。未破裂的顱內動脈瘤典型為無癥狀性，而顱內動脈瘤的破裂能夠導致蛛網膜下隙出血，從而導致重癥殘疾[2]。 近年來基因組相關研究已經發現了多種與顱內動脈瘤相關的疾病基因位點，如染色體9p21位點[3]。此外，還發現了一些與動脈瘤顯著相關的基因。 Friend白血病集成轉錄因子-1(Friend leukemia integration 1 transcription factor，Fli-1)是ETS轉錄因子家族中的一員,首次發現在由小鼠白血病病毒 (F-MuLV)引起的紅白血病中。Fli-1在多種良性或惡性腫瘤中都呈現高表達。該基因已被發現在血管生成中起重要作用，因此被認為是治療動脈瘤的潛在的基因靶標[4]。生物信息預測發現Collagen Type Ⅰα1(COL1A1)、Tenascin C(TNC)是Fli-1調控的靶基因，與動脈瘤的發生發展聯系緊密[5,6]。雖然這些研究已證實基因在顱內動脈瘤形成中的作用，然而這些基因在顱內動脈瘤形成和破裂的病理生理機制仍不完全明確。本研究通過收集破裂和未破裂的動脈瘤患者外周血，并以健康人作為對照，分離獲得單個核細胞，采用實時定量PCR對分析差異表達的候選基因，以明確Fli-1及其靶基因在顱內動脈瘤患者血液單核細胞中的表達情況。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究經倫理委員會同意，所有患者均來自2014-01～2015-12期間在本院神經外科經數字減影血管造影診斷為顱內動脈瘤，年齡31-84歲，男性14例，女性27例。同時從我院體檢中心募集健康對照者10名。實驗前，所有患者均簽訂了本院提供的知情同意書。

1.2 試劑與儀器

高速低溫離心機購自美國Sigma公司，生物安全柜購自美國Thermo公司，低速自動平衡離心機購自湖南湘儀，酶標儀購自TECAN公司，熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；人淋巴細胞分離液購自達科為公司，RNA抽提試劑Trizol購自美國Life Technology公司，RNA逆轉錄試劑盒購自日本Takara公司，SYBR Green試劑盒購自美國ABI公司，PCR引物由上海生工生物合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 人外周血淋巴細胞分離 取新鮮全血，用等體積的0.9%NaCl/PBS稀釋血液后，按照1∶1的比例加入適量的淋巴細胞分離液，隨后輕輕將稀釋后的血液加在分離液的上方，避免混合。1 500 r/min離心30 min后，吸棄干凈最上層的黃色血清，將中間層的溶液(白色)轉移至15 ml離心管中，加入等量的PBS/1640培養基，混勻后，離心(1 000 r/min，5 min)。如還可見紅細胞，離心后去上清，用3 ml紅細胞裂解液反應1 min左右，1 000 r/min離心5 min，用PBS洗滌2遍。計數培養，保存于-80 ℃。

1.3.2 RNA提取 將上述獲得的細胞加1 ml Trizol混勻，室溫放置15 min，使其充分裂解，然后轉入1.5 ml離心管。加入0.2 ml氯仿，振蕩混勻后室溫放置15 min。4 ℃ 12 000×g離心15 min。吸取上層水相，至另一離心管中。加入0.5 ml異丙醇混勻，-20 ℃沉淀。4 ℃ 12 000×g離心10 min，棄上清，RNA沉于管底。用75%乙醇洗滌RNA沉淀，每使用1 ml Trizol加入1 ml 75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。4 ℃ 12 000×g離心5 min，盡量棄上清。室溫晾干或真空干燥5-10 min。用20 μl DEPC H2O溶解RNA樣品，55-60 ℃，5-10 min。RNA純度的測定和RNA的定量采用NanoDrop 2000進行，以相應溶劑為對照(Blank)，取2 μl RNA溶液于酶標儀上檢測樣本濃度和質量。

1.3.3 實時定量RT-PCR實驗 將上述獲得的總RNA，以Oligo dT12作為引物，每份加入1-5 μg RNA按照Takara公司PrimeScript RT逆轉錄試劑盒的說明書操作進行逆轉錄反應。實時定量PCR檢測采用SYBR Green染料進行，以GAPDH作為內參基因，檢測基因Fli-1，COL1A1及TNC，這些基因的引物序列的設計根據GeneBank公布的cDNA序列進行設計，具體見表1。定量PCR的反應體系如下：SYBR Premix Ex Taq(2×)10 μl，前向引物和反向引物1 μl，cDNA 2 μl，10×Buffer 2 μl, dNTP 2 μl,加ddH2O至總體積20 μl。反應條件為50 ℃保持3 min；95 ℃熱變性3 min；95 ℃變性10 s；60 ℃復性30 s；40個循環，并于60-95 ℃時取溶解曲線。隨機軟件自動地計算出最適合的標準曲線方程式，并根據域值算出各樣品Ct值與拷貝數，結果應用2-ΔΔCt法[7]進行分析。

表1 實時定量PCR引物序列

Table 1 The primer sequences for real-time quantification PCR

基因名稱前向引物(5'-3')反向引物(5'-3')Fli-1 GCGACGACCAGTCCCTCTTT GCTGATTGATCCACTCCTGCTCOL1A1 GCAAGGTGTTGTGCGATGACG TTGGTCGGTGGGTGACTCTGTNC GAGCAATCCAGCGACCATCA GAGACTGTAATTGAGGCGGTAGAPDH TGACAACTTTGGTATCGTG-GAAGG AGGCAGGGATGATGTTCTG-GAGAG

2 結果

2.1 外周血RNA的濃度和純度

采用Trizol法從顱內動脈瘤患者及健康對照外周血單個核細胞樣本中抽提的總RNAA260/A280比例在1.8-2.1之間，結果見表2。

2.2 實時定量RT-PCR結果

我們對3種候選基因采用實時定量PCR進行了檢測，可見在顱內動脈瘤中差異表達的基因有2個，分別為Fli-1和COL1A1。經進一步分組發現，相比于未發生破裂的動脈瘤患者，基因Fli-1(破裂組vs未破裂組為1.75±0.81vs1.25±0.56)和COL1A1(破裂組vs未破裂組為3.76±4.01vs2.00±2.90)在破裂的顱內動脈瘤患者中的表達有顯著升高(P<0.05，見圖1，2)。

表2 顱內動脈瘤患者和健康對照者外周血單核細胞RNA純度和濃度

Table 2 The RNA purity and concentration of peripheral blood mononuclear cells in intracranial aneurysm patients and controls

樣本A260A280A260/A280濃度(ng/μl)C10.5590.2782.011447.52C20.270.1381.956215.76C31.040.5431.915832.16C41.7230.9051.9031378.32C50.5560.2891.924444.72C72.41.2551.9121920.24C80.6430.3212.003514.56C90.6520.3152.070521.36C100.5820.2981.953465.36P10.5990.311.932479.12P20.8530.4361.956682.64P30.4110.2111.948328.72P40.2910.1452.007232.48P51.130.631.793432.24P60.790.3792.082134.18P70.5010.2352.132505.14P81.2710.622.050441.23P91.9540.9612.0321335.1P100.7870.3782.082456.12P112.6311.32.0241222.11P120.8740.4212.0731345.36P130.6130.3261.880566.32P140.7930.3912.028421.55P150.5330.2711.967564.3P161.0840.5262.059112.4P170.6020.3151.911354.1P180.5220.2651.970223.1P191.3610.6652.047199.6P201.0210.4952.063456.4P210.7320.3512.088299.9P221.5020.7362.042289.59P230.4850.2571.8871100.3P241.1140.5412.057784.3P251.0440.5062.061232.48W11.0610.5152.0601159.3W21.3150.6422.0481044.9W30.8730.4212.074877.6W40.7530.3612.086766.35W51.5920.782.040544.23W61.2520.612.051599.1W70.9630.4662.067225.32W81.7330.8512.03644.48W92.4161.1922.02618.56W101.2490.6092.051641.58W111.0930.5611.948877.63W121.3450.6572.047344.56W131.2750.6222.050655.48W141.2920.632.049832.48W151.5460.7871.964198.75W160.8970.4941.816222.89

C.健康對照組；P.動脈瘤破裂患者； W.動脈瘤未破裂患者

對照組 ∶未破裂組∶破裂組=1.05(0.34) ∶1.25(0.56) ∶1.75(0.81);與其他兩組比較,*P<0.05圖1 PCR檢測Fli-1基因在顱內動脈瘤患者和健康者中的相對表達量 Figure 1 The relative expression of Fli-1 in intracranial aneurysm patients and controls by PCR

對照組 ∶未破裂組 ∶破裂組=1.12(0.53) ∶2.00(2.90) ∶3.76(4.01);與其他兩組比較，*P<0.05圖2 PCR檢測COL1A1基因在顱內動脈瘤患者和健康者中的相對表達量Figure 2 The relative expression of COL1A1 in intracranial aneurysm patients and healthy controls by PCR

3 討論

近來全基因組關聯研究已經明確多個與顱內動脈瘤風險相關的基因位點和基因[8,9]。目前研究中最常報道的基因變異體位點位于染色體9p21[10]。與動脈瘤相關的基因如：基質分解素-1(Stromelysin-1) 被證實在動脈瘤患者中過表達，對 Stromelysin-1的研究為動脈瘤的發生發展、診斷及治療起到重大的作用。這些研究證實基因在顱內動脈瘤形成中的作用，然而有關顱內動脈瘤形成和破裂的病理生理機制仍不完全明確。在破裂和未破裂的顱內動脈瘤中對基因表達水平進行比較將為導致顱內動脈瘤破裂的生理機制的闡明提供強大的工具，這為臨床醫生為患者選擇優化的治療方案提供了可能。之前相關基因芯片分析的結果顯示多種生物學通路包括炎癥應答、免疫系統、細胞外基質及細胞凋亡等均參與到顱內動脈瘤的形成、進展及破裂中。由于動脈瘤的生物學狀態具有異生性，因此比較破裂顱內動脈瘤及未破裂顱內動脈瘤的基因表達差異存在一定的難度[11,12]。在本研究中，我們通過收集破裂與未破裂的顱內動脈瘤患者的外周血，并以正常人外周血作為對照，分離血液單核細胞，提取總RNA，實時定量RT-PCR檢測候選基因的表達差異。我們的結果顯示在檢測的Fli-1和2個靶基因中，Fli-1和COL1A1基因在顱內動脈瘤中顯著差異表達。經進一步分組發現，相比于未發生破裂的動脈瘤患者，這兩個基因在破裂的顱內動脈瘤患者中的表達有顯著升高。我們認為破裂與未破裂顱內動脈瘤患者之間Fli-1及COL1A1的表達水平差異可能與動脈瘤的破裂存在相關性。

Fli-1是Ets家族轉錄因子，其能夠與GGA(A/T)一致核心基序結合來調控靶基因的表達[13]。Fli-1最先被認為能夠整合到Friend鼠白血病病毒的位點上。隨著數據的累積，Fli-1被發現能夠作為調控者參與到多種細胞過程中，如細胞的發育、分化和增殖[13]。正常生理條件下，Fli-1主要在造血干細胞和血管內皮細胞中表達，Fli-1基因的過表達能夠促進血液瘤和實體瘤的發生[14]。此外，Fli-1表達失調還與自身免疫病的發生有關[15]。進一步研究發現，Fli-1在血管生成中起重要作用，可以將其作為動脈瘤診斷及治療的新靶點。例如有研究發現Fli-1基因缺失的小鼠，在胚胎期中即出現血管發育不完整，從而導致顱內出血，表明Fli-1在血管生成、重構的基因調控中起關鍵的作用[16]。在本研究中，我們發現Fli-1基因在破裂的顱內動脈瘤患者中的表達有顯著升高，該結果提示Fli-1參與到顱內動脈瘤的病情進展中。Fli-1的高表達可能增加了顱內動脈瘤破裂的風險。

Peters等[17]之前研究采用SAGE-Lite對一名3歲的顱內動脈瘤女孩的組織進行了基因表達檢測，結果顯示編碼細胞外基質組分的基因過表達，此外還有細胞外基質降解，細胞黏附和抗黏附，細胞因子生成及細胞遷移的基因也發生顯著改變，在這些基因中包括了COL1A1基因。此外，在COL1A1突變的小鼠體內，顱內血管壁發育不良的概率要比正常對照組高[18]。結果表明COL1A1基因突變可能與顱內囊性動脈瘤相關發生發展相關。我們的結果顯示COL1A1基因在破裂的顱內動脈瘤患者中的表達有顯著升高，該結果提示COL1A1可能參與到顱內動脈瘤的病情進展中。

本文也有一些不足之處:第一,患者數量相對較少，因此可能對基因的表達水平檢測的結果存在偏倚。第二，由于時間緊促，我們未對這些基因在顱內動脈瘤發生和發展中的具體作用及機制進行明確，這需要在不遠的未來通過進一步的研究來證實。

綜上所述，我們的結果顯示破裂與未破裂顱內動脈瘤患者之間Fli-1及COL1A1的表達水平差異可能與動脈瘤的破裂表現存在相關性。可根據關鍵基因在患者體內的表達水平，預測發生動脈瘤破裂的可能性，這兩個基因可能在臨床上作為顱內動脈瘤是否破裂的預測因子。對于動脈瘤患者能夠早發現、早預防、早治療，緩解疾病對病人造成的嚴重精神壓力和心理恐慌。也為早期診斷顱內動脈瘤，防止動脈瘤破裂，在合適時間采取合適治療手段提供理論上的參考價值。

[1] Vlak MH,Algra A,Brandenburg R,etal.Prevalence of unruptured intracranial aneurysms, with emphasis on sex,age,comorbidity,country,and time period:A systematic review and meta-analysis[J].Lancet Neurol,2011,10(7):626-636.

[2] Nieuwkamp DJ,Setz LE,Algra A,etal.Changes in case fatality of aneurysmal subarachnoid haemorrhage over time,according to age,sex,and region:A meta-analysis[J].Lancet Neurol,2009,8(7):635-642.

[3] Mohan D,Munteanu V,Coman T,etal.Genetic factors involves in intracranial aneurysms-actualities[J].J Med Life,2015,8(3):336-341.

[4] Hart A,Melet F,Grossfeld P,etal.Fli-1 is required for murine vascular and megakaryocytic development and is hemizygously deleted in patients with thrombocytopenia[J].Immunity,2000,13(2):167-177.

[5] Hamada K,Miura Y,Toma N,etal.Gellan sulfate core platinum coil with tenascin-c promotes intra-aneurysmal organization in rats[J].Transl Stroke Res,2014,5(5):595-603.

[6] Wei L,Gao YJ,Wei SP,etal.Transcriptome network-based method to identify genes associated with unruptured intracranial aneurysms[J].Genet Mol Res,2013,12(3):3263-3273.

[7] Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative pcr and the 2(-delta delta c(t)) method[J].Methods,2001,25(4):402-408.

[8] Bilguvar K,Yasuno K,Niemela M,etal.Susceptibility loci for intracranial aneurysm in european and japanese populations[J].Nat Genet,2008,40(12):1472-1477.

[9] Yasuno K,Bilguvar K,Bijlenga P,etal.Genome-wide association study of intracranial aneurysm identifies three new risk loci[J].Nat Genet,2010,42(5):420-425.

[10] Alg VS,Sofat R,Houlden H,etal.Genetic risk factors for intracranial aneurysms:A meta-analysis in more than 116,000 individuals[J].Neurology,2013,80(23):2154-2165.

[11] Li L,Yang X,Jiang F,etal.Transcriptome-wide characterization of gene expression associated with unruptured intracranial aneurysms[J].Eur Neurol,2009,62(6):330-337.

[12] Pera J,Korostynski M,Krzyszkowski T,etal.Gene expression profiles in human ruptured and unruptured intracranial aneurysms:What is the role of inflammation?[J].Stroke,2010,41(2):224-231.

[13] Li Y,Luo H,Liu T,etal.The ets transcription factor fli-1 in development,cancer and disease[J].Oncogene,2015,34(16):2022-2031.

[14] Gao P,Yuan M,Ma X,etal.Transcription factor fli-1 positively regulates lipopolysaccharide-induced interleukin-27 production in macrophages[J].Mol Immunol,2016,71(184-191.

[15] Sato S,Lennard Richard M,Brandon D,etal.A critical role of the transcription factor fli-1 in murine lupus development by regulation of interleukin-6 expression[J].Arthritis Rheumatol,2014,66(12):3436-3444.

[16] Asano Y,Markiewicz M,Kubo M,etal.Transcription factor fli1 regulates collagen fibrillogenesis in mouse skin[J].Mol Cell Biol,2009,29(2):425-434.

[17] Peters DG,Kassam AB,Feingold E,etal.Molecular anatomy of an intracranial aneurysm:Coordinated expression of genes involved in wound healing and tissue remodeling[J].Stroke,2001,32(4):1036-1042.

[18] Marjamaa J,Tulamo R,Abo-Ramadan U,etal.Mice with a deletion in the first intron of the col1a1 gene develop dissection and rupture of aorta in the absence of aneurysms:High-resolution magnetic resonance imaging,at 4.7 t,of the aorta and cerebral arteries[J].Magn Reson Med,2006,55(3):592-597.

(P>0.05), but correlated with the tumor size and subtotal resection(P<0.05).For the patients with positive COL6A1 expression in GBM, the overall survival time was obviously shorter than those with negative COL6A1 expression(P<0.05).ConclusionCOL6A1 may be involved in GBM development and progression, and it is considered as a new therapeutic target for GBM.

Key words: Collagen-Ⅵ-alpha-1； gliobastoma； survival

Differential expression of Fli-1 and its target genes in patients with intracranial aneurysm

WEI Liang, YANG Cheng, ZHANG Yanfei, WANG Qi, GUAN Hongxin, SUN Zhiyang*

(DepartmentofNeurosurgery,EastHospital,TongjiUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200120,China；*Correspondingauthor,E-mail:dfsunzy@126.com)

ObjectiveTo investigate the expression of Fli-1 and its target genes in patients with intracranial aneurysm.MethodsBlood samples from 41 intracranial aneurysm patients(25 ruptured and 16 unruptured) and 10 healthy controls were collected. Peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) were isolated for total RNA exaction. The expression of 3 candidate genes predicted by informatics method were assessed by real-time quantitative PCR.ResultsOf the 4 candidate genes, 2 differential expressed genes such as Fli-1 and COL1A1 were found in patients with intracranial aneurysm. Further analysis revealed that the expression of Fli-1 and COL1A1 gene was significantly increased in patients with ruptured intracranial aneurysm compared with those in unruptured patients.ConclusionDifferential expression of Fli-1 and COL1A1 between patients with and without ruptured intracranial aneurysm may be correlated with the ruptured phenotype in patients with intracranial aneurysm.

intracranial aneurysm; differential expressed genes; Fli-1; COL1A1

上海市衛計委基金面上基金資助項目(201440319)

魏亮，男，1978-01生，碩士，副主任醫師，E-mail:weiliangdf@163.com

2016-09-03

R739.41

A

1007-6611(2016)11-1012-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.11.013