對肝臟胰島素抵抗誘發膽結石機制的研究

陶文雅 朱 峰 王 晨 徐 韋

（蘇州大學附屬第三醫院肝膽外科 江蘇 常州 213000）

膽結石主要是指發生在膽囊內的結石，其主要成分為膽固醇。膽結石患者的臨床表現主要為腹痛、厭食油膩食物等，其生活質量可受到嚴重的影響[1]。調查數據顯示，美國約有2000萬的膽結石患者，每年用于治療此病的醫藥費用約為560億美元[2]。目前，我國尚無關于膽結石的流行病學調查數據，但估計此病的發病率應在4%-7%之間。膽結石的病因較多，主要包括體形肥胖、長期禁食、服用避孕藥、攝入過多的低纖維食物及發生代謝綜合征等。研究結果證實[3]，向心性肥胖、糖尿病及其并發癥、心血管疾病等代謝相關性疾病均與膽結石的發病有密切的關系。胰島素抵抗是誘發代謝綜合征和糖尿病的關鍵性因素。近年來的研究發現，胰島素抵抗與膽結石的發病也有一定的關系，但其誘發膽結石的病理機制尚不明確。為了分析肝臟胰島素抵抗誘發膽結石的機制，我們將肝臟胰島素受體被敲除的C57BL/6小鼠作為模型小鼠，將健康的C57小鼠作為正常小鼠，對比觀察兩種小鼠在攝入高脂飲食后發生膽結石的情況、在攝入正常飲食時其體內膽汁酸的分泌量、其膽汁酸合成相關酶、法尼酯衍生物X受體（FXR）、腺苷三磷酸結合盒轉運體Abcg5和Abcg8 的表達、其肝臟和膽汁中膽固醇的濃度及膽汁的膽固醇飽和指數（CSI）等指標，現將相關的情況報告如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

本實驗所用的模型小鼠為肝胰島素受體被敲除的C57BL/6小鼠，由南京大學模式動物中心提供，屬于SPF級雄性小鼠，其體重在18-22g之間。本實驗所用的正常C57小鼠由中國科學院上海實驗動物中心提供，屬于SPF級雄性小鼠，其體重在18-22g之間，其許可證號為SCXK（滬）2007-0005。

1.2 實驗試劑及儀器

胰島素注射液（購自江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司）；Trizol（購自invitrogen公司）；RIPA裂解液（購自碧云天生物技術研究所）；FXR羊抗鼠一抗以及兔抗山羊二抗（購自美國Santa cruz公司）；SYBRgreen、ECL發光液（購自北京天根生物科技有限公司）；膽酸、膽固醇檢測試劑盒（購自南京建成生物工程研究所）；Roche LightCycler 480熒光定量PCR儀（購自瑞士Roche公司）；Bio-Rad western blot系統（購自美國Bio-Rad公司）；酶標儀（購自美國Thermo Fisher公司）。

2 方法

2.1 實驗方法

1）取正常小鼠和模型小鼠各20只，為其中10只正常小鼠和10只模型小鼠皮下注射胰島素，1 IU/d，共用藥3周；為另外10只正常小鼠和10只模型小鼠皮下注射蒸餾水，1 IU/d，共用藥3周。將這40只小鼠用高脂飲食（含0.5%的膽酸、1%的膽固醇及15%的脂肪乳）進行飼養，在第3周后將其處死，取其膽汁進行檢查。小鼠的膽汁內若有肉眼可見的粗大顆粒，而且在光鏡下可見大團塊的膽固醇結晶可判定其發生膽結石。觀察并統計這些小鼠發生膽結石的情況。2）取正常小鼠及模型小鼠各10只，分別收集其糞便，用試劑盒檢測其糞便中膽汁酸的含量。取這些小鼠的肝組織100 mg，經液氮研磨處理后加 入Trizol，提取出RN A，經逆轉錄獲 得cDNA，使用PCR分別檢測其中膽汁酸合成相關酶Cyp7a1、 Cyp8b1、Cyp7b1、Cyp27a1、法尼酯衍生物X受體（farnesoid-X-receptor，FXR）、腺苷三磷酸結合盒轉運體Abcg5和Abcg8 的mRNA表達，以GAPDH作為內參進行Ct值的統計。取這些小鼠的肝組織100 mg，經研磨后使用RIPA裂解液進行裂解，制備成western blot實驗樣本，經聚丙烯凝膠酰胺電泳分離后轉膜、封閉，采用FXR抗體進行孵育，用ECL發光液進行顯色，用Bio-Rad機進行信號讀取，用GELsoftware軟件獲取結果（以GAPDH作為內參）。3）取正常小鼠及模型小鼠各10只，分別收集其肝組織及膽汁，用試劑盒檢測其肝組織和膽汁中膽固醇的濃度，采用Carey表計算其膽汁的膽固醇飽和指數（Choleesterol saturation index, CSI）。

2.2 統計學分析

采用SPSS17.0統計軟件對本實驗中的數據進行分析，計量資料采用平均值±標準差（）表示，組間比較采用方差分析及t檢驗，計數資料以%表示，采用x2檢驗，P＜0.05差異有統計學意義。

3 結果

3.1 對正常小鼠及模型小鼠攝入高脂飲食后發生膽結石情況的分析

將模型小鼠用高脂飼料飼養3周后，共有83%的小鼠發生膽結石，可見胰島素受體被敲除的小鼠易發生膽結石。在注射胰島素后，正常小鼠及模型小鼠膽結石的發生率均有所增高，模型小鼠膽結石的發生率達100%。可見，為小鼠注射胰島素可誘發高胰島素血癥，加重其發生的胰島素抵抗，加速其體內膽結石的形成。詳情見圖1。

圖1 對各組小鼠在攝入高脂飲食后膽結石發生率的分析

3.2 正常小鼠及模型小鼠在攝入正常飲食時其體內膽汁酸的水平及膽汁酸相關合成基因的表達

與正常小鼠相比，模型小鼠體內膽汁酸的分泌量明顯較 少（P＜ 0.05）， 其 體 內 Cyp7a1、 Cyp8b1、 Cyp7b1和Cyp27a1的mRNA表達明顯降低（P＜0.05），其體內FXR的mRNA表達與蛋白表達也明顯降低（P＜0.05）。可見，發生肝臟胰島素抵抗的小鼠可因體內膽汁酸的分泌減少而減弱機體對膽結石的消化及清除能力。詳情見圖2。

圖2 兩組小鼠體內膽汁酸的含量（A）、Cyp7a1、Cyp8b1、 Cyp7b1和 Cyp27a1 的 mRNA 表達（B）、FXR 的mRNA表達（C）和蛋白表達（D）

3.3 對正常小鼠及模型小鼠肝臟和膽汁中膽固醇濃度的檢測結果分析

與正常小鼠相比，模型小鼠的肝膽固醇的濃度和CSI均較高（P＜0.05），其體內Abcg5和Abcg8的mRNA表達及蛋白表達也較高（P＜0.05）。可見，發生肝臟胰島素抵抗的小鼠可因體內Abcg5、Abcg8的表達增高、膽汁中的膽固醇增多而加速膽結石的形成。詳情見圖3。

圖3 兩組小鼠體內CSI（A）、肝組織中膽固醇的含量（B）、Abcg5和Abcg8的 mRNA表達（C）及蛋白表達（D）

4 討論

胰島素抵抗與膽結石的形成之間有著密切的聯系。研究發現，膽結石在正常人群中的發病率不到10%，在糖尿病患者中的發病率在30%以上[4]。

在本研究中，我們采用肝胰島素受體被敲除的小鼠作為胰島素抵抗模型小鼠，為其最大限度地進行了肝臟發生胰島素抵抗的實驗[5]。在攝入高脂飲食3周后，模型小鼠膽結石的發生率是正常小鼠的8倍。可見，發生肝臟胰島素抵抗可顯著增加小鼠膽結石的發病率。據報道，肝臟胰島素抵抗導致膽結石的病理機制主要有以下幾種[6]：1）肝臟在發生胰島素抵抗后，肝臟內膽固醇合成的限速酶HMGGOA還原酶的活性可顯著增高，進而促進肝臟內膽固醇的合成。2）肝臟在發生胰島素抵抗后可抑制膽汁酸的分泌及膽鹽的合成，促進膽結石的形成。3）肝臟在發生胰島素抵抗后，LDL（低密度脂蛋白）的活性可顯著增高，進而可增加膽汁中膽固醇的含量及膽汁中鈣離子的含量。我們在本次研究中發現，肝臟胰島素抵抗導致膽結石的病理機制還包括以下兩個：1）肝臟在發生胰島素抵抗后，膽固醇轉運體Abcg5和Abcg8的表達可急劇升高，膽汁內膽固醇的含量也隨之升高，進而可導致膽結石。2）肝臟在發生胰島素抵抗后，調節膽汁酸合成的分子FXR[7]的表達可顯著降低，膽汁酸的分泌可顯著減少，進而可減弱機體對膽結石的消化能力。合成膽汁酸是動物體內進行膽固醇代謝的主要途徑，Cyp7a1、 Cyp8b1、 Cyp7b1和 Cyp27al均會參與膽汁酸的合成，而這些分子又受到FXR的調控[8]。膽汁中膽固醇偏高與膽結石的發病有直接的關系。膽汁中膽固醇的分泌主要受膽固醇轉運體Abcg5和Abcg8的調節。Abcg5和Abcg8的表達水平升高可導致轉運至膽汁中的膽固醇增多，進而可促進膽結石的形成[9]。

本研究的結果顯示，將模型小鼠用高脂飼料飼養3周后，其中有83%的小鼠發生膽結石。與正常小鼠相比，模型小鼠體內膽汁酸的分泌量明顯較少（P＜0.05），其體內Cyp7a1、 Cyp8b1、 Cyp7b1和 Cyp27a1的 mRNA 表 達 明 顯降低（P＜0.05），其體內FXR的mRNA表達與蛋白表達也明顯降低（P＜0.05）。與正常小鼠相比，模型小鼠體內肝膽固醇的濃度和CSI均較高（P＜0.05），其體內Abcg5和Abcg8的mRNA表達及蛋白表達也較高（P＜0.05）。可見，發生肝臟胰島素抵抗的小鼠可因FXR、Cyp7a1、 Cyp8b1、Cyp7b1和Cyp27a1的表達降低，膽汁酸的分泌減少及Abcg5和Abcg8的表達升高，導致膽汁中膽固醇的濃度增加而加速膽結石的發病。