HPLC-Q-TOF-MS/MS法檢測(cè)降壓類(lèi)中成藥中非法添加的24種化學(xué)物質(zhì)Δ

凌海燕，湯 燕，朱 寧，楊 軍，文 筱，楊安東（四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，成都 610041）

HPLC-Q-TOF-MS/MS法檢測(cè)降壓類(lèi)中成藥中非法添加的24種化學(xué)物質(zhì)Δ

凌海燕＊，湯 燕，朱 寧，楊 軍，文 筱，楊安東#（四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，成都 610041）

目的：建立檢測(cè)降壓類(lèi)中成藥中非法添加的24種化學(xué)物質(zhì)的方法。方法：采用高效液相色譜-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法。色譜條件：色譜柱為Agilent Poroshell 120 EC-C18，流動(dòng)相為0.05%甲酸溶液-甲醇（梯度洗脫），流速為0.3 ml/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為5 μl。質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離源，毛細(xì)管電壓為4.0 kV，毛細(xì)管出口電壓為135 V，錐孔電壓為65 V，脫溶劑溫度為350℃，干燥氣流速為10 L/min，霧化器壓力為40 psi，碰撞能量為8～45 V，掃描范圍為m/z 100～1 700，檢測(cè)方式為正離子模式（ESI+）。結(jié)果：卡托普利、硝苯地平、氫氯噻嗪、鹽酸可樂(lè)定、利血平檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為2.0～32 μg/L，苯磺酸氨氯地平、非洛地平、纈沙坦、拉西地平、坎地沙坦酯檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為3.0～48 μg/L，其余14種化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為2.5～40 μg/L（r≥0.995 9）；定量限≤2.944 1 ng，檢測(cè)限≤0.988 5 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD≤5.1%；回收率為81.5%～115.5%（RSD＝1.81%～4.86%，n＝9）。結(jié)論：該方法專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便快捷，適用于降壓類(lèi)中成藥中非法添加化學(xué)物質(zhì)的檢測(cè)。

高效液相色譜-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法；降壓類(lèi)中成藥；化學(xué)物質(zhì)；非法添加

由于我國(guó)高血壓患病率逐年攀升，使得治療高血壓的藥物幾乎成為每個(gè)家庭的必備藥。不少患者傾向于選擇毒副作用小的中藥復(fù)方制劑，不法分子利用這種心理，在降壓中成藥中非法摻入療效確切、價(jià)廉的降壓化學(xué)物質(zhì)，服用者雖可收到立竿見(jiàn)影的效果，但會(huì)造成化學(xué)藥品用法用量的無(wú)法控制、重復(fù)用藥，對(duì)患者身體帶來(lái)極大損害。由于中成藥成分和生產(chǎn)工藝的復(fù)雜性，不可能與化學(xué)物質(zhì)同時(shí)進(jìn)行全程檢測(cè)，所以添加的化學(xué)物質(zhì)不易被識(shí)別，具有隱蔽性。目前，用于檢測(cè)中成藥中非法添加化學(xué)物質(zhì)的方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[1-3]等，隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，高分辨質(zhì)譜越來(lái)越受到人們的關(guān)注，與串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜相比，高分辨質(zhì)譜具有掃描速度快、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。

本試驗(yàn)建立的HPLC-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法（Q-TOF-MS/ MS）具有高靈敏度、高選擇性的特點(diǎn)，可以獲得高質(zhì)量質(zhì)譜圖和化學(xué)物質(zhì)精確分子質(zhì)量，操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，結(jié)果可靠。

1 材料

1.1 儀器

LC-Q-TOF聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：100 W，頻率：40 kHz）。

1.2 藥品與試劑

試驗(yàn)所用樣品均為市售降壓類(lèi)丸劑、片劑、膠囊劑中成藥（編號(hào)：1～12）；卡托普利對(duì)照品（批號(hào)：100318-201103）、氯沙坦鉀對(duì)照品（批號(hào)：100597-201102）、纈沙坦對(duì)照品（批號(hào)：100651-201203）、替米沙坦對(duì)照品（批號(hào)：100629-201202）、坎地沙坦酯對(duì)照品（批號(hào)：100685-200401）、奧美沙坦酯對(duì)照品（批號(hào)：100864-201302）、酒石酸美托洛爾對(duì)照品（批號(hào)：100084-201102）、阿替洛爾對(duì)照品（批號(hào)：100117-201105）、富馬酸比索洛爾對(duì)照品（批號(hào)：100711-200401）、鹽酸普萘洛爾對(duì)照品（批號(hào)：100783-201202）、尼莫地平對(duì)照品（批號(hào)：100270-200002）、尼群地平對(duì)照品（批號(hào)：100585-201104）、苯磺酸氨氯地平對(duì)照品（批號(hào)：100374-201204）、硝苯地平對(duì)照品（批號(hào)：100338-201404）、拉西地平對(duì)照品（批號(hào)：100741-200802）、鹽 酸 尼 卡 地 平 對(duì) 照 品（批 號(hào) ：100586-201102）、非洛地平對(duì)照品（批號(hào)：100717-201403）、甲磺酸多沙唑嗪對(duì)照品（批號(hào)：100566-200401）、鹽酸肼屈嗪對(duì)照品（批號(hào)：100263-200301）、氫氯噻嗪對(duì)照品（批號(hào)：100309-201404）、鹽酸可樂(lè)定對(duì)照品（批號(hào)：100071-201106）、利血平對(duì)照品（批號(hào)：100041-201213）、吲達(dá)帕胺對(duì)照品（批號(hào)：100257-201204）、鹽酸哌唑嗪（批號(hào)：100147-201206）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、甲酸為色譜純，水為超純水（18.25 mΩ/cm）。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相：0.05%甲酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0 min，10%B；0～5 min，10%→60%B；5～15 min，60%→95%B；15～20 min，95%B；20～25 min，10%B）；流速：0.3 ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5 μl。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧電離（ESI）源；毛細(xì)管電壓：4.0 kV；毛細(xì)管出口電壓：135 V；錐孔電壓：65 V；脫溶劑溫度：350℃；干燥氣流速：10 L/min；霧化器壓力：40 psi；碰撞能量：8～45 V；掃描范圍：100～1 700 m/z；檢測(cè)方式：正離子模式（ESI+）。在ESI+模式下，各化學(xué)物質(zhì)有較好的分離度，并且24種化學(xué)物質(zhì)在20 min內(nèi)出峰，檢測(cè)時(shí)間較短，在進(jìn)行非法添加篩查時(shí)可以大大提高效率。總離子流見(jiàn)圖1。

圖1 總離子流圖Fig 1 Total ion chromatograms

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別取坎地沙坦酯、卡托普利、氯沙坦鉀、奧美沙坦酯、尼群地平、替米沙坦、纈沙坦、阿替洛爾、非洛地平、酒石酸美托洛爾、鹽酸普萘洛爾、硝苯地平、尼莫地平、鹽酸可樂(lè)定、苯磺酸氨氯地平、利血平、拉西地平、鹽酸哌唑嗪、鹽酸尼卡地平、吲達(dá)帕胺、甲磺酸多沙唑嗪、氫氯噻嗪、鹽酸肼屈嗪、富馬酸比索洛爾對(duì)照品10.05、9.97、9.52、10.23、10.12、10.54、10.09、9.14、9.69、10.48、9.89、10.20、10.27、9.60、10.17、10.15、9.62、9.24、9.77、9.62、9.19、10.23、10.32、10.16 mg，精密稱(chēng)定，分別置于25 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，作為單一對(duì)照品貯備液。精密量取上述單一對(duì)照品貯備液1 ml，置于50 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，作為混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取片劑或丸劑樣品研細(xì)，混勻，或取膠囊劑，取出內(nèi)容物連同膠囊殼細(xì)致研磨粉碎，取一次口服劑量，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，加甲醇50 ml，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出，放冷至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)，取濾液1.00 ml，置于10 ml量瓶中，加0.05%甲酸-甲醇（90∶10，V/V）定容，作為供試品溶液。

2.2.3 空白樣品溶液 缺樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備空白樣品溶液。

2.3 24種化學(xué)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)信息

建立24種化學(xué)物質(zhì)的分子式、精確質(zhì)量數(shù)、二級(jí)特征碎片離子以及保留時(shí)間等信息數(shù)據(jù)庫(kù)（見(jiàn)表1），通過(guò)分析軟件分別對(duì)待測(cè)成分的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖與數(shù)據(jù)庫(kù)中質(zhì)譜圖進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)結(jié)合保留時(shí)間進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)證。

表1 標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)信息Tab 1 Information of standard reference library

續(xù)表1Continued tab 1

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.1、0.4、0.8、1.2、1.6 ml，分別置于50 ml量瓶中，加0.05%甲酸-甲醇（90∶10，V/V）定容，制成系列混合對(duì)照品溶液。精密量取上述系列混合對(duì)照品溶液各5 μl，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，詳見(jiàn)表2。結(jié)果表明，卡托普利、硝苯地平、氫氯噻嗪、鹽酸可樂(lè)定、利血平檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為2.0～32 μg/L；苯磺酸氨氯地平、非洛地平、纈沙坦、拉西地平、坎地沙坦酯檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為3.0～48 μg/L；其余14種化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為2.5～40 μg/L。

表2 回歸方程與定量限、檢測(cè)限Tab 2 Regression equations，limits of detection and limits of quantification

2.5 定量限與檢測(cè)限考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，等倍逐步稀釋?zhuān)础?.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測(cè)限，詳見(jiàn)表2。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，24種化學(xué)物質(zhì)峰面積的RSD＝2.6%～4.9%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：6）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、12、18、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，24種化學(xué)物質(zhì)峰面積的RSD＝2.3%～5.1%（n＝7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一批樣品（編號(hào)：6）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄氫氯噻嗪峰面積。結(jié)果，氫氯噻嗪的添加量為3.50 g/kg，RSD＝4.0%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn)

取空白樣品適量，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量的待測(cè)成分對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 3 Results of recovery tests（n＝9）

續(xù)表3Continued tab 3

2.10 樣品中化學(xué)物質(zhì)的測(cè)定

取12種市售降壓中成藥各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣檢測(cè)，若檢出，則計(jì)算化學(xué)物質(zhì)含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的補(bǔ)充批件（編號(hào)2009032）[6]僅對(duì)降壓中成藥中的7種降壓類(lèi)化學(xué)物質(zhì)（阿替洛爾、鹽酸可樂(lè)定、氫氯噻嗪、卡托普利、哌唑嗪、利血平、硝苯地平）進(jìn)行篩查和驗(yàn)證，篩查的對(duì)象遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于本研究所選擇的24種化學(xué)物質(zhì)，故本研究方法的適用范圍更廣。這24種化學(xué)物質(zhì)極性差別大，要在同一個(gè)色譜系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)色譜分離需要較長(zhǎng)時(shí)間，且有部分成分的色譜保留行為相似，分離度較差，例如尼莫地平、尼群地平、硝苯地平、非洛地平、苯磺酸氨氯地平等。因此，采用EC-C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）填料的色譜柱，建立的HPLC-Q-TOF-MS/MS法測(cè)定降壓中成藥中非法添加的化學(xué)物質(zhì)的定性定量檢驗(yàn)方法，能夠在20 min內(nèi)完成24種降壓類(lèi)化學(xué)物質(zhì)的有效分析，并排除了中成藥中復(fù)雜成分的干擾，且從保留時(shí)間、一級(jí)及二級(jí)質(zhì)譜的一致性等方面保證了定性定量的準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便和高靈敏度。在缺乏對(duì)照品的情況下，可以將未知樣品的特征譜圖與譜庫(kù)信息進(jìn)行匹配，以此實(shí)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)對(duì)未知成分進(jìn)行初步篩查和確認(rèn)的目的。這是一個(gè)開(kāi)放的系統(tǒng)，可以隨時(shí)增加新的化學(xué)物質(zhì)，只要將相應(yīng)的數(shù)據(jù)錄入質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，便可進(jìn)行日常檢驗(yàn)篩查，為用藥安全提供技術(shù)支持。

表4 樣品中非法添加化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果（n＝3）Tab 4 Detection results of the chemical substances that illegally added in samples（n＝3）

[1] 陳惠玲，封令霞.HPLC檢測(cè)中藥中非法添加化學(xué)降壓藥物[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2011，28（13）：1 346.

[2] 陳海濱，吳春敏.降壓類(lèi)中成藥非法添加化學(xué)藥物研究近況[J].海峽藥學(xué)，2010，22（10）：1.

[3]李濤，朱小紅，林芳.GC-MS聯(lián)用方法檢測(cè)降壓類(lèi)中成藥及保健食品中非法添加的化學(xué)藥物[J].藥物分析雜志，2010，30（11）：2 212.

[4] 吳寧鵬，班付國(guó)，彭麗，等.超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法篩查飼料中11種鎮(zhèn)靜劑類(lèi)藥物[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2012，33（2）：94.

[5] 謝寒冰，周明瑩，趙海峰，等.高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)豆芽中的3種外源植物激素殘留

[J].色譜，2014，32（5）：493.

[6] 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件[S].2009.

Detecion of 24 Chemical Substances that Illegally Added into Antihypertensive Traditional Chinese Patent Medicines by HPLC-Q-TOF-MS/MS

LING Haiyan，TANG Yan，ZHU Ning，YANG Jun，WEN Xiao，YANG Andong（Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences，Chengdu 610041，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the detection of 24 chemical substances that illegally added into antihypertensive traditional Chinese medicines.METHODS：HPLC-Q-TOF-MS/MS was adopted.The chromatographic conditions were as follows，the column was Agilent Poroshell 120 EC-C18with mobile phase of 0.05%formic acid-methanol（gradient elution）at a flow rate of 0.3 ml/min，column temperature was 30℃，injection volume was 5 μl.MS conditions were as follows，ion sou-rce was an electrospray ionization source，capillary voltage was 4.0 kV，capillary exit voltage was 135 V，cone voltage was 65 V，desolvation temperature was 350℃，drying gas flow rate was 10 L/min，nebulizer pressure was 40 psi，collision energy was 8-45 V；scanning range was m/z 100-1 700；and detection method was positive ion mode（ESI+）.RESULTS：The linear range was 2.0-32 μg/L for captopril nifedipine，hydrochlorothiazide，clonidine hydrochloride，reserpine，3.0-48 μg/L for amlodipine besylate，felodipine，valsartan，lacidipine，candesartan cilexetil and 2.5-40 μg/L for the other 14 chemical substances（r≥0.995 9）；limit of quantification was not higher than 2.944 1 ng，the limit of detection was not higher than 0.988 5 ng；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were no higher than 5.1%；recoveries were 81.5%-115.5%（RSD were 1.81%-4.86%，n＝9）.CONCLUSIONS：The method is specific，sensitive，simple and rapid，and suitable for the detection of chemical substances that illegally added into antihypertensive traditional Chinese medicines.

HPLC-Q-TOF-MS/MS；Antihypertensive traditional Chinese patent medicine；Chemical substances；Illegal added

R917

A

1001-0408（2016）33-4712-04

2016-03-28

2016-07-14）

（編輯：張 靜）

四川省公益性科研院所基本科研項(xiàng)目（No.A-2015N-7）

＊助理研究員，碩士。研究方向：中藥及天然產(chǎn)物新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。電話：028-85257327。E-mail：hyan1012@126.com

#通信作者：研究員，博士。研究方向：中藥及天然產(chǎn)物新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)、中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和中藥材綜合應(yīng)用與成套技術(shù)開(kāi)發(fā)。E-mail：ady-05@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.33.35