HPLC法同時測定克敏乳膏中3種成分的含量

陳曉亮，汪旭（1.?？谑腥嗣襻t(yī)院藥學(xué)部，海口 570208；2.長春八一醫(yī)院藥劑科，長春 130024）

HPLC法同時測定克敏乳膏中3種成分的含量

陳曉亮1＊，汪旭2#（1.海口市人民醫(yī)院藥學(xué)部，?？?570208；2.長春八一醫(yī)院藥劑科，長春 130024）

目的：建立同時測定克敏乳膏中鹽酸利多卡因、馬來酸氯苯那敏和氯霉素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為WondaSil C18，流動相為甲醇-乙腈-0.1%磷酸（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測波長為254 nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為10 μl。結(jié)果：鹽酸利多卡因、馬來酸氯苯那敏和氯霉素的檢測進(jìn)樣量線性范圍分別為0.604 5～2.871 4 μg（r＝0.999 9）、0.169 9～0.807 0 μg（r＝0.999 9）、0.326 5～1.550 9 μg（r＝0.999 9）；定量限分別為3.17、1.50、2.33 ng，檢測限分別為0.95、0.45、0.70 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2%；加樣回收率分別為98.29%～100.10%（RSD＝0.64%，n＝9）、98.04%～100.70%（RSD＝0.80%，n＝9）、98.02%～99.81%（RSD＝0.70%，n＝9）。結(jié)論：該方法結(jié)果準(zhǔn)確、精密度高，可用于同時測定克敏乳膏中鹽酸利多卡因、馬來酸氯苯那敏和氯霉素的含量。

克敏乳膏；高效液相色譜法；鹽酸利多卡因；馬來酸氯苯那敏；氯霉素；含量測定

克敏乳膏為長春八一醫(yī)院自擬處方、自主研發(fā)的院內(nèi)制劑，是由鹽酸利多卡因、馬來酸氯苯那敏和氯霉素3種主要化學(xué)成分及乳膏基質(zhì)制成的外用復(fù)方制劑，具有抗炎、抗過敏、鎮(zhèn)痛止癢等作用[1-2]，臨床上用于治療急慢性濕疹、皮膚瘙癢等疾病?，F(xiàn)有文獻(xiàn)多為對其單一成分進(jìn)行含量測定，不能有效控制該制劑的質(zhì)量。因此，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[3-6]采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時測定克敏乳膏中鹽酸利多卡因、馬來酸氯苯那敏和氯霉素含量的方法，以期為該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-2010AHT型HPLC儀，包括自動進(jìn)樣器、紫外分光光度檢測器、LC solution工作站（日本Shimadzu公司）；PB-10型萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；KQ-3200E型數(shù)控超聲波處理器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：150 W，頻率：40 kHz）。

1.2 藥品與試劑

克敏乳膏（長春八一醫(yī)院制劑室自制，批號：20150401、20150402、20150403，規(guī)格：20 g/支）；鹽酸利多卡因?qū)φ掌罚ㄅ枺?00341-201403，純度：93.4%）、馬來酸氯苯那敏對照品（批號：100047-200606，純度：99.7%）、氯霉素對照品（批號：130555-201203，純度：99.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：WondaSil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇（A）-乙腈（B）-0.1%磷酸（C），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：254 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μl。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取鹽酸利多卡因、馬來酸氯苯那敏、氯霉素對照品各適量，置于同一250 ml量瓶中，加95%乙醇溶解并定容，搖勻，制成每1 ml含鹽酸利多卡因0.16 mg、馬來酸氯苯那敏0.04 mg、氯霉素0.08 mg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取樣品0.40 g，置于50 ml棕色量瓶中，加95%乙醇溶解并定容，稱定質(zhì)量，于80℃超聲處理40 min，冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，加95%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的處方比例和工藝制備缺鹽酸利多卡因、馬來酸氯苯那敏和氯霉素的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以鹽酸利多卡因峰、馬來酸氯苯那敏峰和氯霉素峰計(jì)分別為3 500、7 000、8 000，保留時間分別為13.0、16.5、32.0 min。結(jié)果表明，其他成分對測定無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液4、7、10、13、16、19 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表2。

2.5 定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時，得定量限（LOQ）；當(dāng)信噪比為3∶1時，得檢測限（LOD），結(jié)果見表3。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，鹽酸利多卡因、馬來酸氯苯那敏和氯霉素峰面積的RSD分別為0.10%、0.08%、0.11%（n＝6），表明儀器精密度良好。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.鹽酸利多卡因；2.馬來酸氯苯那敏；3.氯霉素Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed control；B.test sample；C.negative control；1.lidocaine hydrochloride；2.chlorpheniramine maleate；3.chloramphenicol

表2 回歸方程與線性范圍Tab 2 Regression equations and linear ranges

表3 定量限與檢測限測定結(jié)果Tab 3 Determination results of quantitation limit and detection limit

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號：20150401）適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、16、24 h時按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，鹽酸利多卡因、馬來酸氯苯那敏和氯霉素峰面積的RSD分別為0.12%、0.25%、0.21%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號：20150401）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，鹽酸利多卡因、馬來酸氯苯那敏和氯霉素的平均含量分別為18.417 7、5.166 0、10.063 1 mg/g，RSD分別為0.05%、0.09%、0.09%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取樣品（批號：20150401）適量，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量的鹽酸利多卡因、馬來酸氯苯那敏和氯霉素對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表4。

2.10 樣品含量測定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表5。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 4 Results of recovery tests（n＝9）

表5 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 5 Results of contents determination of samples（n＝3，mg/g）

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇[7-8]

本品為復(fù)方乳膏制劑，處方較復(fù)雜。筆者在供試品溶液制備過程中分別選擇了50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇為提取溶劑。結(jié)果，95%乙醇和甲醇對樣品的提取率最高且相同，考慮提取成本及毒性因素，本試驗(yàn)最終選擇95%乙醇作為提取溶劑。

3.2 流動相的選擇

本試驗(yàn)曾分別以2015年版《中國藥典》（二部）[9]中鹽酸利多卡因、馬來酸氯苯那敏和氯霉素含量測定項(xiàng)下的流動相進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。結(jié)果，以鹽酸利多卡因含量測定項(xiàng)下磷酸鹽緩沖液-乙腈（50∶50，V/V）為流動相時，馬來酸氯苯那敏與氯霉素色譜峰均延遲，且氯霉素峰拖尾；以馬來酸氯苯那敏含量測定項(xiàng)下磷酸鹽緩沖液-乙腈（80∶20，V/V）為流動相時，氯霉素峰拖尾；以氯霉素含量測定項(xiàng)下0.01 mol/l庚烷磺酸鈉緩沖溶液-甲醇（68∶32，V/V）為流動相時，鹽酸利多卡因峰與乳膏基質(zhì)峰分離度不佳，且鹽酸利多卡因與馬來酸氯苯那敏色譜峰理論板數(shù)及對稱因子均較差。最后，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]的流動相，并在此基礎(chǔ)上添加了極性相對較大的乙腈溶液調(diào)整流動相的比例，以甲醇-乙腈-0.1%磷酸為流動相（梯度洗脫）進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，結(jié)果鹽酸利多卡因、馬來酸氯苯那敏和氯霉素的分離度均較好且峰型對稱。因此，本試驗(yàn)選擇甲醇-乙腈-0.1%磷酸為流動相進(jìn)行梯度洗脫。

3.3 檢測波長的選擇

經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[9]，鹽酸利多卡因、馬來酸氯苯那敏和氯霉素的紫外吸收波長分別為254、262、277 nm。預(yù)試驗(yàn)時，以262和277 nm為檢測波長，馬來酸氯苯那敏和氯霉素的峰面積及峰形均較好，而鹽酸利多卡因峰面積卻較??；以254 nm為檢測波長時，鹽酸利多卡因有最大紫外吸收，其峰面積、峰形及分離度均達(dá)到要求，且馬來酸氯苯那敏和氯霉素峰形也較好，故本試驗(yàn)選擇254 nm作為檢測波長。

綜上所述，本方法結(jié)果準(zhǔn)確、精密度高，可用于同時測定克敏乳膏中鹽酸利多卡因、馬來酸氯苯那敏和氯霉素的含量。

[1] 盛國榮.復(fù)方利多卡因乳膏的抗炎鎮(zhèn)痛和抗過敏止癢的實(shí)驗(yàn)觀察[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30（3）：217.

[2] 何淵民，楊艷，廖勇梅，等.復(fù)方利多卡因乳膏治療慢性局限型濕疹37例隨機(jī)、雙盲對照的臨床觀察[J].中國皮膚性病學(xué)雜志，2015，29（10）：1 026.

[3] 李宏，盛國榮.HPLC測定復(fù)方利多卡因乳膏中的利多卡因和馬來酸氯苯那敏[J].華西藥學(xué)雜志，2015，30（4）：490.

[4] 任睿，陳林，李英，等.HPLC法同時測定復(fù)方地克軟膏中3組分的含量[J].中國藥房，2015，26（30）：4 277.

[5] 楊平，曾蔚欣，孫路路.HPLC法同時測定氯霉素醋酸曲安奈德乳膏中兩組分含量[J].中國藥師，2016，19（3）：591.

[6] 阿不都西克日·阿不都力米提，卡斯木·卡哈爾，滕亮，等. HPLC法測定痤瘡酊中氯霉素和水楊酸的含量[J].中國藥房，2015，26（18）：2 557.

[7] 汪旭，嚴(yán)鐵，高中華，等.HPLC法測定復(fù)方丙酸氯倍他索軟膏中丙酸氯倍他索和維A酸的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報，2015，31（6）：489.

[8] 汪旭，黃翠，嚴(yán)鐵，等.HPLC法測定皮康凈乳膏中醋酸氟輕松和丹皮酚的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報，2015，31（5）：396.

[9] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：62-63、978-979、1 397-1 398.

（編輯：劉柳）

Simultaneous Determination of Three Ingredients in Kemin Cream by HPLC

CHEN Xiaoliang1，WANG Xu2（1.Dept.of Pharmacy，Haikou People's Hospital，Haikou 570208，China；2.Dept. of Pharmacy，Bayi Hospital of Changchun，Changchun 130024，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the contents determination of lidocaine hydrochloride，chlorpheniramine maleate and chloramphenicol in Kemin cream.METHODS：HPLC was performed on the column of WondaSil C18with mobile phase of methanol-acetonitrile-0.1%phosphoric acid（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，detection wavelength was 254 nm，column temperature was 25℃and injection volume was 10 μl.RESULTS：The linear range was 0.604 5-2.871 4 μg for lidocaine hydrochloride（r＝0.999 9），0.169 9-0.807 0 μg for chlorpheniramine maleate（r＝0.999 9）and 0.326 5-1.550 9 μg for chloramphenicol（r＝0.999 9）；limit of quantitation was 3.17，1.50，2.33 ng，limit of detection was 0.95，0.45，0.70 ng；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recoveries were 98.29%-100.10%（RSD＝0.64%，n＝9），98.04%-100.70%（RSD＝0.80%，n＝9）and 98.02%-99.81%（RSD＝0.70%，n＝9），respectively.CONCLUSIONS：The method is accurate with high precision，and can be used for the simultaneous determination of lidocaine hydrochloride，chlorpheniramine maleate and chloramphenicol in Kemin cream.

Kemin cream；HPLC；Lidocaine hydrochloride；Chlorpheniramine maleate；Chloramphenicol；Content determination

R917

A

1001-0408（2016）33-4725-03

2015-11-30

2016-08-10）

＊主管藥師，碩士。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話：0898-66151101。E-mail：41802931@qq.com

#通信作者：主管藥師，碩士。研究方向：藥劑學(xué)。電話：0431-86933827。E-mail：wangxujlu@foxmail.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.33.39