HPLC法測(cè)定利心丸中毛蕊花糖苷的含量

于士婷，趙大慶，李修剛，白雪媛#，趙 雨（.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 307；.長(zhǎng)春市修和商貿(mào)有限公司，長(zhǎng)春 30000）

HPLC法測(cè)定利心丸中毛蕊花糖苷的含量

于士婷1＊，趙大慶1，李修剛2，白雪媛1#，趙 雨1（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130117；2.長(zhǎng)春市修和商貿(mào)有限公司，長(zhǎng)春 130000）

目的：建立測(cè)定利心丸中毛蕊花糖苷含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為ZORBAX SB-Aq，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（16∶84，V/V），流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為334 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μl。結(jié)果：毛蕊花糖苷檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍為0.254 4～1.526 4μg（r＝0.999 7）；定量限為1.358 6μg/ml，檢測(cè)限為0.407 6μg/ml；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2%；加樣回收率為95.06%～97.31%（RSD＝1.05%，n＝6）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于測(cè)定利心丸中毛蕊花糖苷的含量。

利心丸；毛蕊花糖苷；高效液相色譜法；含量測(cè)定

利心丸由貂心、茯苓、地黃、天冬、防己、牡丹皮、琥珀和朱砂等8味中藥材組成，具有補(bǔ)心安神的功效，可用于治療風(fēng)濕性心臟病、心動(dòng)過速、心律不齊、心力衰竭等心血不足之證者。毛蕊花糖苷是利心丸原料地黃中的主要有效成分，具有保護(hù)神經(jīng)、降血糖等作用[1]。

利心丸收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑》（第8冊(cè)）（WS3-B-1546-93）[2]，該標(biāo)準(zhǔn)關(guān)于利心丸的質(zhì)量控制過于簡(jiǎn)單，主要采用顯微和紫外分光光度法進(jìn)行鑒別，而目前的相關(guān)文獻(xiàn)主要集中在丹皮酚的含量測(cè)定及對(duì)地黃、防己和牡丹皮的薄層色譜定性鑒別[3-6]，且沒有對(duì)毛蕊花糖苷的含量測(cè)定報(bào)道。因此，筆者采用高效液相色譜法（HPLC）建立了測(cè)定利心丸中毛蕊花糖苷含量的方法，以期為完善利心丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包括G1311A型四元泵、G1315B型二級(jí)管陣列檢測(cè)器、G1322A型脫氣機(jī)、ChemStation數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)Aglient公司）；HH-2型恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；DHG-9070A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；CP225D型萬分之一電子天平（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

利心丸（吉林特研藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20141201、20141202、20141203、20141204、20141205，規(guī)格：3 g/袋）；毛蕊花糖苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：15040713，純度：99.57%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-Aq（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（16∶84，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：334 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密量取毛蕊花糖苷對(duì)照品4.24 mg，置于50 ml量瓶中，加甲醇制成每1 ml含毛蕊花糖苷84.8μg的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品適量，粉碎成細(xì)粉，取約6.0 g，精密稱定，置于250 ml錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，加熱回流提取1.5 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，并用流動(dòng)相定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 取不含地黃的其余藥材，按樣品的制備工藝和處方比例制備缺地黃的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以毛蕊花糖苷峰計(jì)＞4 000，保留時(shí)間為15.954 min。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.毛蕊花糖苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.negative control；1.verbascoside

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液3、6、9、12、15、18 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以毛蕊花糖苷進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得毛蕊花糖苷的回歸方程為y＝361.1x+6.4（r＝0.999 7）。結(jié)果表明，毛蕊花糖苷檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍為0.254 4～1.526 4μg。

2.5 定量限與檢測(cè)限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限為1.358 6μg/ml；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測(cè)限為0.407 6μg/ml。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，毛蕊花糖苷峰面積的RSD＝1.66%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20141201）適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、6、8 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，毛蕊花糖苷峰面積的RSD＝1.50%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)：20141201）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積并計(jì)算平均含量。結(jié)果，毛蕊花糖苷的平均含量為54.7μg/g，RSD＝1.98%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：20141201）適量，約6.0 g，精密稱定，共6份，置于250 ml錐形瓶中，加入一定質(zhì)量的毛蕊花糖苷對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.10 樣品含量測(cè)定

取5批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of contents determination of samples（n＝3）

3 討論

3.1 提取方法和提取溶劑的選擇

筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[7-10]考察了不同提取方式（回流提取、超聲提取和索氏提取）以及不同溶劑（甲醇、50%甲醇、75%甲醇）對(duì)樣品的處理。結(jié)果，以甲醇經(jīng)回流提取的提取率最高，且經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證其專屬性好。因此，本試驗(yàn)選擇甲醇為提取溶劑，回流提取為提取方法。

3.2 流動(dòng)相的選擇

筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[11-13]，分別考察了乙腈-0.1%乙酸溶液、甲醇-0.1%乙酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液等不同比例的溶液作為流動(dòng)相。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.1%磷酸溶液（16∶84，V/V）作為流動(dòng)相時(shí)的分離效果最好。因此，本試驗(yàn)選擇以乙腈-0.1%磷酸溶液（16∶84，V/V）為流動(dòng)相。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于測(cè)定利心丸中毛蕊花糖苷的含量。

[1] 劉晶，鄒偉，安利佳.從現(xiàn)代衰老學(xué)說談地黃的抗衰老作用研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)雜志，2008，35（6）：952.

[2] 衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑：第8冊(cè)[S].1993：80.

[3] 吳楠，張秀麗.HPLC法測(cè)定利心丸中丹皮酚的含量[J].中國(guó)藥事，2009，23（6）：568.

[4] 王喜民，孫文，吳晶.利心丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2014，12（18）：88.

[5] 張紹軒，揚(yáng)軍，王學(xué)農(nóng)，等.利心丸中牡丹皮及防己的薄層色譜鑒別[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20（2）：432.

[6] 張紹軒，張紅巖，司云珊，等.利心丸中生地黃的薄層色譜鑒別[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（2）：506.

[7] 李文斌.HPLC法測(cè)定麥味地黃丸中毛蕊花糖苷的含量[J].中國(guó)藥房，2014，25（28）：2 665.

[8] 何培根，劉菁，李志浩.補(bǔ)益地黃丸中毛蕊花糖苷的含量分析[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2015，29（3）：56.

[9] 王亮，張巧艷，年華，等.用HPLC法測(cè)定地黃葉中毛蕊花糖苷含量[J].藥學(xué)服務(wù)與研究，2015，15（1）：26.

[10] 趙群濤，張紅偉，方永凱，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定芪黃疏糖膠囊中梓醇和毛蕊花糖苷的含量[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2014，32（5）：1 200.

[11] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：124.

[12] 陳天朝，翟來超.HPLC同時(shí)測(cè)定地黃中梓醇與毛蕊花糖苷的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（5）：105.

[13] 陳健，劉錢林，張傳平，等.HPLC法測(cè)定口炎顆粒中毛蕊花糖苷的含量[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2015，15（65）：110.

（編輯：劉 柳）

Content Determination of Verbascoside in Lixin Pill by HPLC

YU Shiting1，ZHAO Daqing1，LI Xiugang2，BAI Xueyuan1，ZHAO Yu1（1.School of Pharmacy，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China；2.Changchun Xiuhe Trading Company，Changchun 130000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the content determination of verbascoside in Lixin pill.METHODS：HPLC was performed on the column of ZORBAX SB-Aq with mobile phase of acetonitrile-1%phosphoric acid solution（16∶84，V/V）at a flow rate of 1.0 ml/min，detection wavelength was 334 nm，column temperature was 30℃，and injection volume was 10 μl.RESULTS：The linear range of verbascoside was 0.254 4-1.526 4μg（r＝0.999 7）；limit of quantification was 1.358 6μg/ml，and limit of detection was 0.407 6μg/ml；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recovery was 95.06%-97.31%（RSD＝1.05%，n＝6）.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate，and suitable for the content determination of verbascoside in Lixin pill.

Lixin pill；Verbascoside；HPLC；Content determination

R917

A

1001-0408（2016）33-4728-03

2016-01-27

2016-08-29）

＊碩士研究生。研究方向：中藥有效成分及產(chǎn)品開發(fā)。E-mail：470687557@qq.com

#通信作者：副研究員，碩士。研究方向：中藥有效成分及產(chǎn)品開發(fā)。E-mail：baixy1212@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.33.40