丁苯酞注射液對小鼠的急性毒性和慢性毒性試驗研究

田小超，何偉亮，劉斯文，楊 蓉，劉素云*

(1.河北醫科大學第二醫院心內科，河北 石家莊 050000；2.河北省人民醫院神經內科，河北 石家莊 050051；3.河北省醫學科學情報研究所查新室，河北 石家莊 050071)

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·論 著·

丁苯酞注射液對小鼠的急性毒性和慢性毒性試驗研究

田小超1，何偉亮2，劉斯文3，楊 蓉1，劉素云1*

(1.河北醫科大學第二醫院心內科，河北 石家莊 050000；2.河北省人民醫院神經內科，河北 石家莊 050051；3.河北省醫學科學情報研究所查新室，河北 石家莊 050071)

目的觀察丁苯酞注射液的急性毒性和長期毒性。方法采用Bliss法觀察丁苯酞注射液對C57BL/6小鼠的急性毒性；連續30 d尾靜脈重復給藥，觀察其對小鼠的長期毒性，分為丁苯酞注射液低、中、高3個劑量組(分別為40、80、160 mg/kg) 和生理鹽水對照組，對一般生理指標、血清丙氨酸轉氨酶、血清天冬氨酸轉氨酶、血清尿素氮、血清肌酐和組織病理學進行檢查。 結果急性毒性試驗結果顯示丁苯酞注射液對小鼠的半數致死量(LD50)為545.1 mg/kg；連續30 d 尾靜脈重復給藥的慢性毒性結果顯示僅高劑量組天冬氨酸轉氨酶升高，其他生化指標、動物攝食量和體質量、臟器系數及組織病理學檢查與對照組相比差異均無統計學意義(P>0.05)。結論合理使用丁苯酞注射液不會對靶動物產生不良反應。

毒性試驗；丁苯酞注射液；小鼠

丁苯酞(dl-3-n-butylphthalide,NBP)為近幾年來我國自主研發的國家Ⅰ類新藥[1]。臨床上已經被列為急性腦梗死診治指南的指導用藥[2]。但有關NBP的不良反應時有報道，主要表現為肝功能異常、胸悶、皮炎和胃腸道反應等[3-5]。隨著NBP引起不良反應報道的日益增多，其安全性問題逐漸引起人們的關注。為探究NBP潛在的安全風險，提高其安全性和質量可控性，本研究應用C57BL/6小鼠對其進行急性毒性試驗和長期毒性試驗，以觀察NBP產生的毒性反應癥狀和嚴重程度，旨在為NBP的安全性再評價提供重要的毒理學資料，也為臨床安全用藥及預防不良反應提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品、動物與儀器 丁苯酞注射液(dl-3-n-butyphthalide，NBP，商品名：恩必普)由石藥集團恩必普藥業提供，批準文號：國藥準字H20100041。實驗動物: C57BL/6小鼠，SPF級，體質量20～25 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號： SCXX(京) 2006-0009。7020 全自動生化分析儀(日本日立公司)。

1.2 研究方法 按照國家食品藥品監督管理局頒布的相關指導原則要求實施[6]。

1.2.1 小鼠經靜脈給藥急性毒性試驗 采用Bliss法，60只小鼠，體質量20～25 g，分為6組，每組10只，單次靜脈注射NBP溶液。根據少量小鼠進行預試驗結果得到NBP的半數致死量(medial lethal dose,LD50)為630 mg/kg，故正式試驗中NBP劑量分別為384.1、429.4、480.1、536.7、600.0、670.8 mg/kg，給藥體積按0.02 mL/g，速度<0.5 mL/min，觀察給藥后小鼠出現中毒的癥狀和時間、表現程度以及小鼠死亡前的特征和死亡時間，并且對死亡小鼠進行剖檢，觀察主要臟器的改變。觀察期為2周。

1.2.2 長期毒性試驗 分別設NBP 低、中、高(40、80、160 mg/kg)3個劑量組和對照(0.9%生理鹽水)組， 每組10只小鼠。均為尾靜脈注射給藥，每天給藥1次，連續給藥30 d。

1.3 觀察指標 ①一般生理指標：記錄死亡小鼠數，并及時了解其死亡原因，觀察存活小鼠的精神狀態、行為活動、糞便性狀等狀況。每3天測量體質量和攝食量。②檢測血清丙氨酸轉氨酶(alanine transaminase,ALT)、天冬氨酸轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)：小鼠最后一次給藥24 h后，心臟采血，應7020全自動生化分析儀測量血清ALT和AST含量。③檢測血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血清肌酐(serum creatinine，SCr)：應用7020全自動生化分析儀測量血液中BUN和SCr的變化。④組織病理學檢查:小鼠經解剖尸體后稱取各臟器質量。一部分心臟、肝臟和腎臟置于10%中性甲醛溶液中固定，常規包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色后于光學顯微鏡下觀察。

2 結 果

2.1 小鼠經靜脈給藥急性毒性試驗 60只小鼠分別以384.1、429.4、480.1、536.7、600.0、670.8mg/kg靜脈注射NBP溶液后，均出現了輕微到嚴重的毒性反應, 直至死亡。 主要的毒性反應為嘔吐, 呼吸急促,自發活動減少，頭部及四肢顫抖、痙攣等反應?！?80.1mg/kg的劑量組中的部分小鼠出現呼吸深慢、口鼻發紺、無自發活動等瀕死癥狀，給藥后3～20min內死亡，死亡發生率隨劑量增加而增加，6個劑量組依次為0、0、10%、40%、80%、100%，死亡小鼠無明顯的性別差異，對死亡小鼠進行尸解，未死亡小鼠在給藥30min后逐漸恢復正常。14d觀察期內存活小鼠體質量未見明顯變化，籠旁觀察未見明顯異常，觀察期結束時對小鼠麻醉后進行大體解剖，小鼠主要臟器心、腦、肺、肝、腎等無肉眼可見病變。

小鼠經靜脈注射NBP的LD50為545.1mg/kg，LD50的95%可信區間為511.5～578.7mg/kg，見圖1。

圖1 小鼠靜脈注射NBP的劑量與死亡率的關系

Figure 1 The relationship between the intravenous NBP dose and the mortality rate in mice

2.2 長期毒性試驗觀測指標結果 給藥期間NBP各劑量組中均未出現小鼠死亡，但在首次給藥后出現少動、步態不穩、 俯臥等現象，0.5～2 h后逐漸得到恢復，高劑量組在給藥后還出現抽搐、狂躁不安等癥狀，其他未見明顯異常。給藥30 d后各組體質量，攝食量，血清ALT、BUN、SCr差異均無統計學意義(P>0.05)。NBP高劑量組AST值較對照組升高(P<0.05)，而低、中劑量組與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 NBP給藥30 d后對各組觀察指標的影響

Table 1 The effect of NBP on observation indexes in different groups on day 30 post-administration

組別體質量(g)攝食量(g)ALT(U/L)AST(U/L)BUN(mmol/L)SCr(μmol/L)對照組 30.2±3.221.0±1.929.2±3.994.6±13.85.3±0.692.8±9.6低劑量組29.6±2.821.1±2.130.8±4.2102.6±16.45.2±0.796.5±10.8中劑量組28.9±3.121.4±2.133.5±5.1118.8±16.25.5±0.5101.2±9.9高劑量組29.3±2.622.0±1.635.3±8.7139.6±15.5*5.8±0.9105.6±19.3F0.3470.6032.17816.3081.4021.827P0.7910.6170.1080.0000.2580.160

*P<0.05與對照組比較(q檢驗)

2.3 病理組織學檢查 小鼠經靜脈連續給藥30 d后，肉眼大體觀檢查各劑量組小鼠主要臟器的形態、外觀與對照組比較，未見明顯異常，臟器系數未見有明顯的統計學改變。病理學檢查方面，與對照組相比，各劑量組小鼠的心臟、肝臟和腎臟的組織未見明顯的病理學改變。

3 討 論

腦卒中是全球引起死亡的第二大疾病，僅次于心臟病，約全球總病死人數的11.13%[7]，其發病率是隨年齡增長而明顯上升的。在我國，腦卒中患病率為260～719/10萬人，類似于發達國家[8]。當前國內外經循證醫學證實能夠有效治療缺血性腦卒中急性期的口服藥物非常有限，僅有阿司匹林和氯吡格雷。因此，研究新的治療缺血性腦血管病成為亟需解決的問題。NBP是一類新型抗腦缺血的藥物，能夠影響腦缺血的多個病理生理過程，具有神經保護、抗血小板凝集、促進血管再通等作用。研究顯示NBP對輕至中度的腦缺血患者的臨床有效率高達70%以上[9]。盡管在2005年NBP作為治療缺血性腦卒中的藥物，獲得國家食品藥品監督管理局的批準并上市，但近年來有關NBP引起的不良反應報道增多。因此，對其進行安全再評價顯得尤為重要。

急性毒性試驗可確定藥物中毒的作用方式和反應情況，并且可以為慢性毒性試驗觀察指標及劑量分組提供重要的參考依據[10]。本研究著重考察了小鼠靜脈注射NBP的急性毒性，結果發現C57BL/6小鼠靜脈注射NBP的LD50為545.1 mg/kg， 大約為有效劑量(小鼠腦缺血模型的有效劑量為 20 mg/kg[11])的25倍以上，給藥后存活小鼠僅出現一過性自發活動減少、俯臥少動等癥狀。表明NBP具有較高的安全性。

慢性毒性試驗則可以深入評價毒物的毒性強度[12]。NBP導致的肝功能異常是文獻報道中的主要不良事件[5]。ALT和 AST主要存在于線粒體和細胞核內， 它們參與體內轉氨基作用，能夠反映蛋白質合成和分解代謝的狀況，進而反映肝功能的狀態。當細胞及線粒體受損時，ALT和 AST釋放入血，使其在血液濃度升高，活性就相應升高。因此，血ALT和 AST的升高表明肝功能受損[13]。本研究結果顯示，只有高劑量組小鼠血清中AST高于對照組(P<0.05)，其他劑量組與對照組差異無統計學意義；而各劑量組血清中ALT值與對照組差異無統計學意義。AST升高考慮可能與NBP濃度過高有關。表明在合理范圍內應用NBP不會引起小鼠肝臟功能的損傷。

BUN和SCr是反映腎功能的重要指標[14-15]。檢測血液中BUN和SCr值可觀察腎臟功能的改變。本研究結果顯示各劑量組BUN和SCr與對照組差異均無統計學意義(P>0.05)， 表明長期應用NBP對小鼠腎臟沒有毒性作用；此外，病理組織學檢查發現各臟器亦無異常變化，提示NBP無明顯不良反應，服用安全。

綜上所述， 急性毒性試驗和慢性毒性試驗結果顯示，在合理范圍內NBP無急性不良反應或毒性較低，并且不會對受試小鼠產生慢性毒性作用，長期使用是安全的。

[1] 吳江，賈建平，崔麗英，等.神經病學[M].2版.北京：人民衛生出版社，2010：153-166．

[2] 中華醫學會神經病學分會腦血管病學組急性缺血性腦卒中診治指南撰寫組．中國急性缺血性腦卒中診治指南2010[J].中華神經科雜志，2010，43(2)：146-153.

[3] 唐鵬，劉玥，劉鵬，等.丁苯酞注射液治療急性腦梗死的初步探討[J].中華老年多器官疾病雜志,2014,13(8):583-586.

[4] 朱以誠，崔麗英,高山，等.丁苯酞注射液治療急性腦梗死的多中心、隨機、雙盲雙模擬、對照Ⅲ期臨床試驗[J].中華神經科雜志,2014,47(2):113-118.

[5] 王德任， 劉鳴， 吳波， 等.丁苯酞治療急性缺血性卒中隨機對照試驗的系統評價[J].中國循證醫學雜志,2010,10(2):189-195.[6] 《化學藥物急性毒性試驗技術指導原則》課題研究組.化學藥物急性毒性試驗技術指導原則[S].北京：國家食品藥品監督管理局，2005：3-15．

[7] Mozaffarian D,Benjamin EJ,Go AS,et al. Heart disease and stroke statistics--2015 update:a report from the American Heart Association[J]. Circulation，2015,131(4):e29-322.

[8] Tan CS,Müller-Riemenschneider F,Ng SH,et al. Trends in stroke incidence and 28-day case fatality in a nationwide stroke registry of a multiethnic Asian population[J]. Stroke，2015,46(10):2728-2734.

[9] 劉明銀，魏麓云.丁苯酞對神經系統保護作用研究進展[J].現代衛生醫藥，2014，30(1)：212-215.

[10] 權曉弟，郝寶成，薛慧文，等.速康解毒口服液對小白鼠的急性毒性試驗和亞慢性毒性試驗[J].西北農業學報，2014,23(8)：20-24.

[11] 張聰，李震中.正丁基苯酞對腦梗死后神經功能恢復作用的機制研究[D].石家莊：河北醫科大學，2015.

[12] 丁中海，王喆，潘國隆，等.聯苯胺對大型溞的急性和慢性毒性試驗[J].應用與環境生物學報,2005,11(1):52-54.

[13] 劉霞,郭書翰,馬雪,等.Lifeceramices對長期飲酒大鼠肝臟的保護作用[J].河北醫科大學學報,2015,36(3):253-256.

[14] 黃文福，陳麗麗，陳海云.對比增強CT受檢者的腎功能及免疫球蛋白變化[J].臨床薈萃,2014,29(11):1268-1276.

[15] 趙帥，耿玉蘭，代麗麗，等.血清中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白檢測診斷急性腎損傷的臨床價值[J].河北醫科大學學報,2013,34(4):416-417.

(本文編輯：劉斯靜)

Studies on the acute and chronic toxicity test of dl-3-n-butylphthalide in mice

TIAN Xiao-chao1, HE Wei-liang2, LIU Si-wen3, Yang Rong1, LIU Su-yun1*

(1.Department of Cardiology， the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China; 2.Department of Neurology， Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, China; 3.Department of Novelty Search，Hebei Medical Science and Information Research Institute, Shijiazhuang 050071, China)

Objective To explore the acute toxicity and chronic toxicity of dl-3-n-butylphthalide(NBP) in mice. Methods The Bliss method was used to observe the acute toxic symptoms and to obtain the toxic parameters medial lethal dose(LD50) of NBP in mice. Repeated administration of tail vein for 30 days, and the long-term toxicity to mice was observed. NBP is divided into low, medium and high dose group(40, 80 and 160 mg/kg respectvely), normal saline was used as control group. The changes of the blood chemistry(alanine transaminase, aspartate aminotransferase, blood urea nitrogen, serum creatinine), and histopathology were examined. Results The LD50 value of the NBP was 545.1 mg/kg. The elevating tendency of the levels of aspartate aminotransferase was observed in the high dose group of NBP. No significant changes were observed in clinical signs, other blood chemistry, and histopathology. Conclusion The rational use of NBP will not have adverse effects on the target animal.

toxicity tests; dl-3-n-butylphthalide; mice

2015-12-28；

2016-05-30

河北省食品藥品監督局科技項目計劃(QN2015019)

田小超(1986-)，女，河北石家莊人，河北醫科大學第二醫院主治醫師，醫學碩士，從事心血管疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail:sxf67@sohu.com

R114

A

1007-3205(2016)11-1250-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.11.003