AMPK-ACC信號通路在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及意義

嚴 麗，李清懷，冀 宏，申 偉，郭 浩，王長全

(1.河北醫科大學第二醫院甲狀腺乳腺外科，河北 石家莊 050000；2.河北省安國市醫院普通外科，河北 安國 071200)

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·論 著·

AMPK-ACC信號通路在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及意義

嚴 麗1，李清懷1，冀 宏1，申 偉1，郭 浩1，王長全2

(1.河北醫科大學第二醫院甲狀腺乳腺外科，河北 石家莊 050000；2.河北省安國市醫院普通外科，河北 安國 071200)

目的觀察磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(phosphorylated AMP-activated protein kinase,pAMPK)和磷酸化乙酰輔酶A羧化酶(phosphorylated acetyl-CoA carboxylase,pACC)在甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)組織中的表達情況，探討AMPK-ACC信號通路在PTC中的表達及意義。方法采用免疫組織化學法和Western blot法分別檢測60例PTC和20例結節性甲狀腺腫組織中pAMPK和pACC的表達情況，分析其與性別、年齡、腫瘤大小、雙側癌、多灶、包膜侵犯、中央區淋巴結轉移和側頸部淋巴結轉移等臨床病理因素的關系。結果pAMPK和pACC在PTC和結節性甲狀腺腫組織中均有表達，pAMPK和pACC在PTC組織中陽性表達率均顯著高于結節性甲狀腺腫(P<0.05)。pAMPK和pACC在PTC中央區淋巴結轉移組中的陽性表達率均顯著高于PTC中央區淋巴結未轉移組(P<0.05)。pAMPK和pACC在PTC側頸部淋巴結轉移組中的陽性表達率均顯著高于PTC側頸部淋巴結未轉移組(P<0.05)。pAMPK和pACC的表達程度與PTC患者的性別、年齡、腫瘤大小、雙側癌、多灶和包膜侵犯等差異均無統計學意義(P>0.05)。Western blot法檢測顯示PTC組織中pAMPK和pACC的表達均顯著高于結節性甲狀腺腫組(P<0.05)。結論pAMPK和pACC在PTC組織中表達增強，并與頸部淋巴結轉移密切相關；AMPK-ACC信號通路的激活在PTC發生和轉移中可能發揮了促進作用。

甲狀腺腫瘤；淋巴結；基因表達調控，酶學

甲狀腺癌是最常見的頭頸部惡性腫瘤，其中以甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)最為常見，占80%～90%。相對于其他惡性腫瘤，PTC具有惡性度低、預后好的特點，但是頸部淋巴結轉移和遠處轉移仍是造成患者生存質量下降和復發率升高的重要因素。能量代謝與腫瘤的發生發展密切相關，腫瘤細胞的無限增殖要有相應的能量代謝支撐，通過調節腫瘤細胞的能量代謝進而抑制腫瘤生長將是腫瘤治療的一個新靶點。腺苷酸活化蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate(AMP)-actired protein kinase,AMPK]是細胞內的“能量調節器”，通過感受細胞內AMP/ATP比例的變化發揮調節作用。AMP升高或ATP降低均可激活AMPK，AMPK激活后可誘導分解代謝，抑制合成代謝，進而抑制細胞增殖，發揮潛在的腫瘤抑制作用。ACC是一種存在于細胞質中的生物素依賴的變構羧化酶，是脂肪酸代謝的限速酶。ACC是AMPK的下游直接底物，當細胞接受刺激或能量消耗增加時，細胞內AMPK含量增加，AMPK使ACC磷酸化形成磷酸化乙酰輔酶A羧化酶(phosphorylated acetyl-CoA carboxylase,pACC)增多，ACC活性降低。檢測細胞內pAMPK 和pACC水平的變化可反映AMPK的活性。本研究分別通過免疫組織化學法和Western blot法檢測PTC組織中pAMPK和pACC的表達情況，分析AMPK-ACC信號通路在PTC發生、發展和轉移中的作用；同時分析PTC組織中pAMPK和pACC的表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、雙側癌、多灶、包膜侵犯、中央區淋巴結轉移和側頸部淋巴結轉移等臨床病理參數之間的關系，旨在為PTC的診斷和治療提供一個新的靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年6月—2015年5月河北醫科大學第二醫院甲狀腺乳腺外科收治的PTC患者60例，術后均經病理證實為甲狀腺乳頭狀癌，男性10例，女性50例，年齡20～65歲，平均(44.68±11.11)歲，其中左葉22例，右葉28例，雙葉10例。手術方式：甲狀腺腺葉、峽部切除+患側中央區(VI區)淋巴結清掃術24例，甲狀腺全切+患側中央區淋巴結清掃術20例(其中3例同時行患側Ⅱ～Ⅴ區淋巴結清掃術)，甲狀腺全切+雙側中央區淋巴結清掃術16例(其中2例同時行單側Ⅱ～Ⅴ區淋巴結清掃術，4例同時行雙側Ⅱ～Ⅴ區淋巴結清掃術)。所有患者均為首次手術，術前均未行任何抗腫瘤治療。另取結節性甲狀腺腫20例作為對照組,男性3例，女性17例，年齡19～68歲，平均(54.75±11.37)歲。2組性別、年齡差異無統計學意義，具有可比性(P<0.05)。

本研究已經河北醫科大學第二醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 兔抗人pAMPK單克隆抗體和兔抗人pACC單克隆抗體(ABGENT公司)，辣根酶標記羊抗兔IgG(Proteintech 公司)，二步法通用型免疫組織化學試劑盒(上海基因公司)，ECL增強化學發光試劑盒(Millipore 公司)。

1.3 免疫組織化學染色 所有標本經4%多聚甲醛固定48 h，常規石蠟包埋方法制作組織蠟塊，連續切片3～5 μm厚。石蠟切片脫蠟至水，抗原修復20 min；3%H2O2室溫孵育5 min；滴加10%山羊血清室溫封閉15 min；分別加入相應一抗：兔抗人pAMPK(1∶200)和兔抗人pACC(1∶200)4 ℃過夜；次日室溫平衡30 min，加入生物素標記的二抗(1:100)室溫孵育45 min；應用DAB顯色試劑盒進行顯色，蘇木精復染，梯度酒精脫水、二甲苯透明、封片；光學顯微鏡下觀察并拍攝圖片。空白對照以PBS代替一抗。應用Image-Pro 軟件進行圖像分析。

1.4 Western blot檢測 取經液氮凍存的新鮮組織100 mg，加入1 mL組織裂解液，充分勻漿后4 ℃離心12 000 r/min，離心15 min，上清即為組織總蛋白。取100 μg蛋白樣品經10%SDS-PAGE 分離并轉膜后，用5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h。依次加入一抗：兔抗人pAMPK(1∶500)、兔抗人pACC(1∶500)和兔抗人β-actin(1∶2 000)4 ℃過夜，次日加入山羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫孵育2 h，滴加ECL發光液，應用奧德賽化學發光成像儀進行檢測，以β-actin作為內對照，應用Quantity one軟件進行圖像分析。

1.5 統計學方法 應用SPSS 19.0軟件進行統計。計量資料比較采用t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 免疫組織化學法檢測 pAMPK和pACC主要表達于細胞質中，結節性甲狀腺腫和PTC組織中均有表達。pAMPK在PTC組織中的陽性表達率高于結節性甲狀腺腫組(P<0.05);pACC在PTC組織中的陽性表達率高于結節性甲狀腺腫組(P<0.05)。見表1，圖1，2。

2.2 Western blot法檢測 pAMPK蛋白在PTC組織中表達強于結節性甲狀腺腫(0.78±0.05vs0.65±0.09)，差異有統計學意義(t=6.499,P<0.05)。pACC蛋白在PTC組織中表達強于結節性甲狀腺腫(0.73±0.19vs0.44±0.03)，差異有統計學意義(t=25.802,P<0.05)(圖3)。

2.3 PTC組織中pAMPK和pACC表達與臨床病理因素的關系 pAMPK在中央區淋巴結轉移組中陽性表達率顯著高于淋巴結未轉移組(P<0.05)；pAMPK在側頸部淋巴結轉移組中陽性表達率顯著高于淋巴結未轉移組(P<0.05)；pACC在中央區淋巴結轉移組中陽性表達率顯著高于淋巴結未轉移組(P<0.05)；pACC在側頸部淋巴結轉移組中陽性表達率顯著高于淋巴結未轉移組(P<0.05)；pAMPK和pACC在PTC患者性別、年齡、腫瘤大小、雙側癌、多灶和侵犯包膜中的陽性表達率差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 pAMPK和pACC在PTC和結節性甲狀腺腫組織中的表達

表2 PTC組織中pAMPK和pACC表達與臨床病理因素的關系

圖1 pAMPK在結節性甲狀腺腫和PTC組織中的表達(免疫組織化學染色 ×40)

A.結節性甲狀腺腫組；B.PTC組

Figure 1 Expression of pAMPK in nodular goiter and PTC(immunohistochemical staining ×40)

圖2 pACC在結節性甲狀腺腫和PTC組織中的表達(免疫組織化學染色 ×40)

A.結節性甲狀腺腫組；B.PTC組

Figure 2 Expression of pACC in nodular goiter and PTC(immunohistochemical staining ×40)

圖3 Western blot檢測 PTC和結節性甲狀腺腫組織中pAMPK、pACC表達

A.結節性甲狀腺腫；B.PTC

Figure 3 The expression of pAMPK and pACC in PTC and nodular goiter were test by western blot

3 討 論

AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶，由α、β和γ 3個亞單位組成，每個亞單位又分為不同的亞型，分別為α1、α2、β1、β2、γ1、γ2和γ3，不同亞單位可以自由排列組合形成不同的異源三聚體。AMPK是細胞和機體能量代謝的主要調節器，其活性受細胞內AMP/ATP比值的調節，當細胞內AMP水平升高或AMP/ATP的比例上升，AMP通過與γ亞基結合，促進α亞基上的第172位蘇氨酸殘基磷酸化后形成AMPK的活化形式pAMPK，抑制合成代謝，促進分解代謝。ACC是一種存在于細胞質中的生物素依賴的變構羧化酶，是脂肪酸代謝的限速酶。當細胞受到刺激或能量消耗增加時，細胞內AMPK含量增加，使ACC磷酸化形成pACC增加而活性降低，減少脂肪合成。AMPK及其下游靶點ACC構成的AMPK-ACC信號通路在機體的多種代謝性疾病中發揮重要作用。

腫瘤細胞在過度增殖過程中，其周圍微環境出現能量消耗增加、缺血、缺氧等改變，腫瘤細胞為抵抗這些影響，會通過多種機制調節局部的能量代謝以適應其生長。AMPK及其家族成員在腫瘤局部的能量代謝中發揮了重要作用，可通過多種機制調節腫瘤細胞的生長和轉移[1-3]。二甲雙胍的抗腫瘤機制就是通過激活抑癌基因LKB1，進而激活AMPK使其磷酸化，導致細胞周期停滯于G1期，發揮抗腫瘤細胞增殖的作用[4-8]。AMPK激活劑5-氨基4-酰胺咪唑核糖核苷酸(5-Aminoimidazole-4-carboxamide1-β-D-ribofuranoside,AICAR)可通過抑制EGFR/pAKT/ERK通路和細胞周期蛋白Cyclin D1的表達，使細胞周期阻滯于G0/G1，減少細胞的有絲分裂，抑制腫瘤細胞增殖[9]。AMPK激活后還可上調腫瘤缺氧微環境中缺氧誘導因子1和血管內皮細胞生長因子的表達，促進腫瘤局部侵襲和淋巴結轉移；缺氧還可直接激活AMPK，抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)促進腫瘤細胞生長PTC[10-12]。

AMPK可表達于正常甲狀腺濾泡細胞中，在調節甲狀腺功能方面發揮一定作用。研究表明，AMPK和促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)2種信號通路相互作用共同調節甲狀腺濾泡細胞的碘攝取，影響甲狀腺激素的合成。在正常甲狀腺濾泡細胞中AMPK對碘攝入的抑制作用與TSH的促進作用達到平衡；應用AICAR和下調TSH均可促進AMPK磷酸化，抑制甲狀腺濾泡細胞的碘攝取和鈉/碘轉運體(sodium iodide symporter,NIS)蛋白的表達[13-14]。Abdulrahman等[15]分別在FRTL-5細胞和C57B16/J小鼠中檢測 AMPK變化對碘攝取和NIS 蛋白的影響，發現二甲雙胍激活AMPK導致碘攝取和NIS蛋白水平顯著下降；AMPK抑制劑Compound C則抑制AMPK導致碘攝取和NIS蛋白水平增強；二甲雙胍和Compound C是通過調節NIS啟動子中的CRE因子的活性進而調節AMPK發揮作用的，并認為AMPK 調節化合物不但可調節甲狀腺濾泡細胞的碘攝取能力，而且對于分化型甲狀腺癌術后的放射碘治療也可發揮一定的臨床調控作用。

AMPK在甲狀腺癌中的作用尚未完全明確。Vidal等[16]應用免疫組織化學方法，檢測tAMPK、pAMPK和pACC在正常甲狀腺和PTC組織中均有表達，但在PTC中表達更強，認為AMPK激活在PTC發生中發揮了促進作用。還有研究認為，AMPK在甲狀腺癌中具有抗增殖和促進細胞凋亡的作用；AICAR通過激活AMPK可抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞TPC-1和BCPAP的增殖、遷移，誘導凋亡，逆轉TPC-1細胞的上皮間質轉化；二甲雙胍通過激活AMPK，可以抑制甲狀腺未分化癌細胞的生長，促進其凋亡[17-18]。Klubo-Gwiezdzinska等[19]發現，二甲雙胍通過抑制mTOR/p70S6K/pS6信號途徑進而抑制甲狀腺髓樣癌細胞的生長，降低Cyclin D1和pERK的表達；但應用AMPK抑制劑或沉默AMPK后并不能阻止二甲雙胍的作用。說明二甲雙胍是通過多種機制來調節其抗腫瘤作用的。

本研究結果顯示，pAMPK和pACC在PTC和結節性甲狀腺腫中均有表達，且主要表達于細胞質中，PTC組織中表達更強，顯著高于結節性甲狀腺腫；Western blot法檢測pAMPK和pACC蛋白在PTC組織中表達均顯著高于結節性甲狀腺腫組織(P<0.05)；中央區淋巴結轉移組和側頸部淋巴結轉移組中pAMPK和pACC的陽性表達率明顯高于淋巴結未轉移組(P<0.05)；pAMPK和pACC在不同性別、年齡、腫瘤大小、雙側癌、多灶和侵犯包膜的陽性表達率差異無統計學意義(P>0.05)。這說明AMPK-ACC信號通路可能參與并促進了PTC的發生和淋巴結轉移。在PTC的發生和發展的過程中，局部微環境出現能量缺失、缺氧，導致AMPK激活，抑制合成代謝促進分解代謝，為腫瘤細胞的生長提供了適宜的環境。同時，PTC發生中AMPK的激活多伴隨碘攝取能力下降，進一步影響術后放射碘治療的效果。

綜上所述，AMPK在甲狀腺癌不同發展階段中的作用可能是雙向的，在腫瘤的不同時期可能扮演了不同的角色，AMPK誘導的能量代謝在PTC中的作用還有待于更深入的研究。合理應用一些AMPK的調節化合物，不僅有助于減緩腫瘤的發展和轉移，還會增強PTC術后放射碘治療的效果。

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(本文編輯：劉斯靜)

The expression and clinical significance of AMPK-ACC signaling pathway in papillary thyroid cancer

YAN Li1, LI Qing-huai1, JI Hong1, SHEN Wei1, GUO Hao1, WANG Chang-quan2

(1.Department of Thyroid and Breast Surgery, the Second Hospital of to Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China; 2.Department of General Surgery, Anguo City Hospital, Hebei Province, Anguo 071200, China)

Objective To investigate the expression and significance of AMPK-ACC signaling pathway in papillary thyroid cancer(PTC) by studying the expression of phosphorylated AMP-activated protein kinase(pAMPK) and phosphorylated acetyl-CoA carboxylase(pACC) in tissues of PTC and their relations to the clinicopathological features. Methods The expression of pAMPK and pACC in tissues of 60 cases of PTC and 20 cases of nodular goiter were detected by immunohistochemical and western blot, and the relationship with age, gender, tumor size, bilateral, multifocal, capsular invasion, lymph node metastasis was analyzed. Results The expression of pAMPK and pACC in tissues of PTC was significantly higher than that in nodular goiter tissues(P<0.05). The expression of pAMPK and pACC in central lymphatic metastases of PTC was significantly higher than that in PTC without central lymphatic metastases(P<0.05). The expression of pAMPK and pACC in lateral lymphatic metastases of PTC was significantly higher than that in PTC without lateral lymphatic metastases(P<0.05). Age, gender, tumor size, bilateral carcinoma, multifocal and capsular invasion were not related to the expression of pAMPK and pACC in PTC(P>0.05). Western blot detection showed pAMPK and pACC expressions in PTC tissue were significantly higher than in nodular goiter(P<0.05). Conclusion pAMPK and pACC are significantly up-regulated in PTC, and the increased degree was closely related to neck lymph node metastasis. The activation of AMPK-ACC signaling pathway may play a role in promoting the occurrence of PTC.

thyroid neoplasms； lymph nodes； gene expression regulation, enzymologic

2016-07-07；

2016-11-08

河北省醫學科學研究重點課題(20150228)

嚴麗(1977-)，女，河北石家莊人，河北醫科大學第

R736.1

A

1007-3205(2016)11-1270-06

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.11.008

二醫院副主任醫師，醫學博士，從事甲狀腺疾病診治研究。