從網絡藥理學角度探討骨關節炎方證對應研究的思路與方法

鄭春松，嚴培晶，付長龍，葉蕻芝，劉獻祥

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建福州350122；

2.福建生物工程職業技術學院，福建福州350002；

3.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建福州350122）

·理論探討·

從網絡藥理學角度探討骨關節炎方證對應研究的思路與方法

鄭春松1，嚴培晶2，付長龍3，葉蕻芝1，劉獻祥1

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建福州350122；

2.福建生物工程職業技術學院，福建福州350002；

3.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建福州350122）

目的建立骨關節炎（OA）方證對應的網絡藥理學研究策略。方法通過基因芯片、代謝組學等得到臨床骨關節炎氣滯血瘀證、寒濕痹阻證、肝腎虧虛證、氣血虛弱證患者與無上述證候、無慢性骨關節炎的關節外傷患者比較的差異基因和代謝物，構建和分析證候分型的分子網絡；查閱膝骨關節炎中醫診療專家共識（2015年版），運用計算模擬與數據建模平臺，構建和分析證候分型代表方與骨關節炎靶基因、靶蛋白、生物通路的作用網絡，找到其關鍵化合物和靶標，并進行實驗驗證。結果形成了OA證候分型的分子網絡研究思路，詮釋證候分型的實質；形成了證候分型代表方的分子網絡研究思路，詮釋各代表方在治療骨關節炎的藥理途徑異同點；建立了網絡中關鍵化合物和靶標的驗證方法，詮釋各代表方對相應證候分型治療中的優勢。結論骨關節炎方證對應的網絡藥理學新方法，將為骨關節炎的個體化診療提供幫助。

骨關節炎；方證對應；網絡藥理學；中醫藥療法；個體化診療

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種以關節軟骨變性、破壞及骨質增生為主要特征的慢性常見病，是中醫骨傷科治療的優勢病種［1-2］。2015年中國中醫藥研究促進會骨傷專業委員會以及中國中西醫結合學會骨傷科專業委員會關節工作委員會形成了膝骨關節炎中醫診療專家共識，認為OA分為氣滯血瘀證、寒濕痹阻證、肝腎虧虛證和氣血虛弱證，分別可以用血府逐瘀湯、蠲痹湯、左歸丸和八珍湯等加減治療［2］。然而，這種中醫臨床的辨證用藥及各種治療方法，以經驗為基礎，缺乏現代的語言，難以被人們普遍理解和接受，阻礙中醫藥成為OA主流療法的可能［3］。網絡藥理學是借助“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網絡平臺，從系統的角度探索藥物對疾病網絡的干預與影響，具有整體性和系統性特點，為中醫藥復雜體系的現代醫學詮釋提供新途徑［4-5］。因此，在膝骨關節炎中醫診療專家共識基礎上，本文首次提出了從網絡藥理學角度開展OA方證對應研究的的思路與方法。

1 理論基礎

方證對應，源于東漢醫家張仲景的《傷寒論》，是探討方藥與病證之間一一對應關系的學說，是作為中醫辨證論治中的一個重要概念［6-7］。分析不同證下的網絡藥理學特征有助于深入研究中醫藥［8］，闡明方藥的藥效物質基礎及機制，篩選出方藥的最佳適應人群，為開展OA的精準醫療提供幫助。

OA屬于中醫的“痹癥”范疇［1，9］，《素問·逆論調篇》曰：“骨痹，是人當攣節也。”《中藏經》曰：“骨痹者，乃食欲不節，傷于腎也。腎氣內消，則不能關禁……。”《素問·長刺節論篇》曰：“病在骨，骨重不可舉，骨髓酸痛，寒氣至，名曰骨痹。”《素問·脈要精微論》曰：“膝者，筋之府，屈伸不能，行則僂俯，筋將憊矣。”《素問·六節臟象論》曰：“肝者，其充在筋。”《素問·痹論》曰：“風寒濕三氣雜至，合而為痹也。其風氣勝者為行痹；寒氣勝者為著痹也。……痹在于骨則重，在于脈則血凝而不流，在于筋則屈不伸，在于肉則不仁，在于皮則寒。”《諸病源候論·風病諸候》曰：“亦有血氣虛，受風邪而得之者”。《景岳全書》曰：“風痹之證，大抵因虛者多，惟氣血不充，故風寒得以入之，惟陰邪留滯，故經脈為之不利。”又曰：“蓋痹者閉也，以血氣為邪所閉，不得通行而病也。”《衛生寶鑒》曰：“老年腰膝久痛，牽引少腹兩足，不堪步履，奇經之脈，隸于肝腎為多。”因此，OA多為“本虛標實”“本痿標痹”之證，臨床上將其分為氣滯血瘀證、寒濕痹阻證、肝腎虧虛證和氣血虛弱證，應采取不同的方藥進行治療。

網絡藥理學是由2007年由University of Dundee的Hopkins AL首次提出［10］，是一種基于網絡數據庫、計算模擬和各組學技術等平臺的新藥發現、藥效物質基礎及作用機制研究方法，系統地揭示了藥物對疾病的干預與影響，具有整體性與動態性的特點，與中醫理論的系統觀和整體論思想不謀而合［11］。中藥復方是中醫預防和治療疾病的主要形式，其物質基礎為四氣五味。一般來說，一種藥物只有一種藥性，但可以有一種或多種氣味。氣味相近，則功效相近。氣味相異，則功效不同。功效不同，則作用機體的靶標也不同，即中藥復方具有多靶點的作用特征［12］。而且，證候是有許多因素組成的復雜系統，難以用單一的生物學指標來表達，其與生物網絡的調節機制具有關聯性［13-14］。因此，借助網絡藥理學，可以從分子層面觀察方與證的內在整體性對應情況，有助于證候客觀化和個體化診療。

2 實驗設計

2.1 選擇與證對應的方藥

2.1.1 OA氣滯血瘀證與血府逐瘀湯OA氣滯血瘀證病人的典型臨床表現：①關節疼痛如刺，休息后痛反甚；②面色黧黑；③舌質紫暗，或有瘀斑，脈沉澀。治法是活血化瘀、通絡止痛，方劑用清代醫家王清任著作《醫林改錯》中的血府逐瘀湯［2］。

2.1.2 OA寒濕痹阻證與蠲痹湯OA寒濕痹阻證病人的典型臨床表現：①關節疼痛重著，遇冷加劇，得溫則減；②腰身重痛；③舌質淡，苔白膩，脈沉。治法是溫經散寒、養血通脈，方劑用清代醫家程鐘齡著作《醫學心悟》中的蠲痹湯［2］。

2.1.3 OA肝腎虧虛證與左歸丸OA肝腎虧虛證病人的典型臨床表現：①關節隱隱作痛；②腰膝酸軟無力，酸困疼痛，遇勞更甚；③舌質紅，少苔，脈沉細無力。治法是滋補肝腎，方劑用明代醫家張景岳著作《景岳全書》中的左歸丸［2］。

2.1.4 OA氣血虛弱證與八珍湯OA氣血虛弱證病人的典型臨床表現：①關節酸痛不適；②少寐多夢，自汗盜汗，頭暈目眩，心悸氣短，面上少華；③舌淡，苔薄白，脈細弱。治法是補氣養血，方劑用元朝醫家朱震亨著作《丹溪心法》中的八珍湯［2］。

2.2 證候分型的OA疾病網絡構建與分析OA組的血樣、關節液、軟骨組織、滑膜組織分別取自行膝關節置換術的氣滯血瘀證、寒濕痹阻證、肝腎虧虛證和氣血虛弱證OA病人，正常組的血樣、關節液、軟骨組織、滑膜組織取自無慢性關節炎、無上述證候分型健康人群中僅因關節外傷引起的病人［15-16］。通過基因芯片技術、蛋白組學和代謝組學技術等，與正常組比較，得到OA組病人中軟骨組織中軟骨細胞、滑膜組織中滑膜細胞的差異基因和蛋白，以及關節液、血樣中差異代謝物，綜合Biological General Repository for Interaction Datasets（BioGRID，http：// www.thebiogrid.org）、Database of Interacting Proteins（DIP，http：//dip.doe-mbi.ucla.edu/dip/Main.cgi）和STRING 10.0（http：//string-db.org/）等數據庫信息及來自文本挖掘的數據［17-18］，在Cytoscape 2.8.3軟件平臺上［19］，直觀顯示OA組證候分型相關的蛋白質-蛋白質相互作用網絡。通過ClueGO、KEGG和REACTOME分析［18，20］，預測其對應的作用通路，建立蛋白質-通路網絡。利用Cytoscape 2.8.3軟件中Plugins面板下的Network analysis，比較OA證候分型的差異性。

2.3 OA“方-證”關聯網絡構建與分析以血府逐瘀湯、蠲痹湯、左歸丸和八珍湯為研究對象，利用“PubChem”“中藥原植物化學成分手冊”“中國知網”等檢索上述方藥的各組成中藥成分，通過Discovery Studio計算模擬與數據建模平臺［21］，構建上述方藥的分子數據庫。以2.2項下的蛋白為靶標，若其有晶體結構，從pdb數據庫（http：//www.rcsb.org/），采用分子對接技術［21］，研究方藥分子數據庫中化合物與靶標的作用；若其無晶體結構，采用藥效團搜索或機器學習方法［22-23］，辨識出作用于靶標的化合物。將化合物、靶標和通路視為節點，相互作用視為邊，在Cytoscape 2.8.3軟件平臺上［19］，構建證候分型對應方藥的化合物-靶標-通路作用網絡。利用Cytoscape 2.8.3軟件中的Network analysis，分析不同方藥對OA證候分型病人所起到的作用，找到不同方藥作用的關鍵靶標和化合物。

2.4 實驗驗證

2.4.1 關鍵靶標的驗證

2.4.1.1 體內實驗以改良Hulth造模法復制大鼠膝骨關節炎為模型［24］，設立血府逐瘀湯組、蠲痹湯組、左歸丸組、八珍湯組和和生理鹽水組，按照藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算［25］，分別給予相應的藥物干預4周后，用戊巴比妥鈉麻醉下腹主動脈采血［26］，并取膝關節的關節液、軟骨組織和滑膜組織［27-28］，借助免疫組化、Elisa和Western blot方法，分析各方藥治療后對應關鍵靶標蛋白表達的變化，證實其作用的關鍵靶標。

2.4.1.2 體外實驗利用2月齡的雄性大鼠，制備大鼠血府逐瘀湯組、蠲痹湯組、左歸丸組、八珍湯組和生理鹽水組的含藥血清。以白細胞介素1β誘導大鼠軟骨細胞建立體外模型，實驗分為血府逐瘀湯組、蠲痹湯組、左歸丸組、八珍湯組和和生理鹽水組，分別給予含10%血府逐瘀湯血清、蠲痹湯血清、左歸丸血清、八珍湯血清、生理鹽水組血清的DMEM培養基培養72 h后，收集其培養液和軟骨細胞［29］。借助免疫組化、Elisa和Western blot方法，分析各方藥含藥血清干預退變軟骨細胞后對應關鍵靶標蛋白表達的變化，證實其作用的關鍵靶標。

2.4.2 關鍵化合物的驗證在關鍵靶標驗證的基礎上，采取固定化藥物靶標方法和分子烙印方法［31-32］，辨識方藥的有效成分，驗證預測的關鍵活性化合物。固定化藥物靶標方法，即將已經驗證的靶標固定在球狀載體上，制備親和色譜，利用靶標對血府逐瘀湯、蠲痹湯、左歸丸和八珍湯中化合物親和力的差異，運用色譜-質譜聯用技術，通過質譜的選擇離子流圖來分析數據，根據化合物在親和色譜柱保留時間的長短，確定化合物對靶標的結合能力，從方藥中篩選和鑒定出活性成分。若難以得到藥物靶標，我們可以通過這個靶標的已知活性配體制備這個靶標的模擬物進行篩選，即分子烙印方法。首先，選擇一個活性分子作為模板分子，然后，選擇合適的功能高分子與之聚合，最后從聚合物中除去模板分子即得到靶標的模擬物，用聚合物作為液相色譜的固定相直接用于方藥血府逐瘀湯、蠲痹湯、左歸丸和八珍湯活性成分的篩選。

3 結語

不同方劑對機體疾病狀態的改善作用會因證候分型不同而具有差異性，通過網絡藥理學，可以更好揭示疾病與證候、證候與方劑之間的關系。本文提出了OA方證對應研究新思路，即以OA的常見證候分型氣滯血瘀證、寒濕痹阻證、肝腎虧虛證、氣血虛弱證為切入點，以各分型對應的代表方血府逐瘀湯、蠲痹湯、左歸丸和八珍湯為示范藥物，采用網絡藥理學方法，觀察OA各證候分型的差異蛋白，以及對應方藥作用的靶標。結合實驗驗證，從微觀角度將方藥和證候有機地對應起來，揭示不同方藥對OA各證候分型網絡的作用情況及方藥中組分間的相互作用規律，從而闡釋OA方證對應模式的科學內涵，使得OA的證候分型研究更具可操作性，促進OA中醫精準治療的發展，對中醫藥現代化研究方法體系和中藥新藥的研發都具有重要的實際意義。

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R275.9

：A

：1000-338X（2016）06-0049-03

2019-09-15

福建省自然科學基金項目（2015J01338）；福建省中青年教師教育科研項目（JA14152）

鄭春松（1982—），男，助理研究員，醫學博士，主要從事中西醫結合骨傷科研究。

劉獻祥（1963—），男，教授，博士生導師。

E-mail：liuxianxiang@163.com