一株罕見手感染克羅彭斯特諾卡菌的鑒定

周世娟

廣東省惠東縣人民醫(yī)院，廣東惠東 516300

一株罕見手感染克羅彭斯特諾卡菌的鑒定

周世娟

廣東省惠東縣人民醫(yī)院，廣東惠東 516300

目的 探討如何鑒定一株罕見克羅彭斯特菌諾卡菌的鑒定方法。 方法 將一株從患者手分離出來的菌株，采用細菌形態(tài)學觀察、菌落生化特性分析、遺傳學分析（如質譜技術、16S rRNA基因擴增后做靶向DNA測序）等相結合的方法進行鑒定。 結果 臨床分離的該罕見菌通過鏡下菌體典型特征（革蘭染色呈90°分枝角G+分枝菌絲，改良Kinyoun染色為陽性）；在血平板、巧克力平板生長緩慢，菌落細小，時間延長起皺褶；觸酶陽性，分解葡萄糖、七葉苷、尿素酶，不分解甘露醇、肌醇、明膠；經(jīng)16S rRNA基因擴增后做靶向DNA測序等綜合分析，最后鑒定為克羅彭斯特諾卡菌（Norcardia Kroppenstedtii)。 結論 各實驗室可依據(jù)細菌形態(tài)學特征、菌落生化特性結合遺傳學分析(如16S rRNA基因擴增后進行靶向DNA測序）鑒定諾卡菌屬，可及時、準確鑒定出克羅彭斯特諾卡菌這類生長緩慢、罕見菌種。

16SrRNA；測序；克羅彭斯特諾卡菌

諾卡菌（Norcardia）在自然界分布廣泛，多為腐生寄生菌，近年來諾卡菌病呈上升趨勢，主要引起肺部疾病、血流感染、皮膚感染及全身播散性感染，臨床病癥復雜多樣[1]。臨床患者感染較常見分離到星形諾卡菌（Norcardia asteroids）和巴西諾卡菌（Norcardia.Brasiliensis），而克羅彭斯特諾卡菌（Norcardia Kroppenstedtii）國內未見報道，國外罕見報道?，F(xiàn)將本院1例克羅彭斯特諾卡菌感染病例的臨床資料及鑒定過程報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

患者男，67歲，農(nóng)民，既往體健。2016年5月因“右食指進行性紅腫伴疼痛”急性起病1周新入院。血常規(guī)提示：白細胞總數(shù)10.32×109/L，中性粒細胞比例84.3%，血紅蛋白141g/L，血小板總數(shù)130×109/L。予以局部穿刺抽膿，膿液送細菌培養(yǎng)。查體：T 36.3℃，P 74次/分，R 20次/min，BP 135/83mm Hg，一般狀況好，心肺腹無特殊，患者神志清，精神軟，?？魄闆r：見右手掌腫脹，以右食指及手掌骨側緣為甚，局部皮膚紅腫，表面無破潰，可見少量黑色藥殘留物（自敷草藥處理，癥狀未見好轉，腫脹呈進行性增大，并向近節(jié)及手掌蔓延），有淤血，局部壓痛（+），可捫及右食指及手掌撓骨波動感，右食指屈曲受損，指端血運可，皮膚感覺無減退。于右食指中節(jié)、近節(jié)橈側緣及手掌膜層，縱向切開腱鞘，見切口流出咖啡色膿液，量約2mL取膿液送微生物室檢查。據(jù)患者口述：膿腫部位一年前曾被竹鍬刺傷后化膿發(fā)炎，當時在當?shù)劓?zhèn)醫(yī)院清創(chuàng)消炎半月痊愈。

1.2檢測用儀器、試劑

儀器：普通培養(yǎng)箱WS2-134-65型（上海躍進）；Olympus CX21顯微鏡（奧林巴斯公司）；3730XL測序儀（ABI公司）等。

試劑：血平板（廣州迪景公司）、巧克力平板、麥康凱平板（梅里埃）等；快速革蘭染液、抗酸（萋-尼氏）染液（珠海貝索公司）；弱抗酸（改良Kinyoun）染液[2]（將抗酸染液Ⅱ液中的脫色劑鹽酸改成1%的鹽酸。改良抗酸染色具體步驟：石炭酸復紅5min→1%硫酸脫色3min→亞甲藍復染3～5min）。

1.3分離與鑒定

分離與鑒定參照《臨床檢驗操作規(guī)程》第4版中的細菌鑒定方法，取咖啡色膿液接種血平板（SBA）、巧克力平板、和麥康凱（MAC）培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)24、48h……觀察菌落。另取膿液直接涂片革蘭染色鏡檢。將血平板（培養(yǎng)48h菌落）上送廣州金域檢驗中心做質譜技術鑒定和靶向DNA測序（16SrRNA基因擴增）鑒定細菌，同時采用微量生化鑒定管對待測菌株進行測定，并延長培養(yǎng)時間5d看結果。

2　結果

2.1臨床治療與結果

此患者入院急診行“右食指膿腫切開引流手術”，術后經(jīng)驗給藥：給予“頭孢噻肟鈉/舒巴坦鈉”抗感染、“七葉皂苷鈉”消腫止痛、“血栓通”改善循環(huán)等對癥治療效果不好，術口換藥時有膿性分泌物滲出，患者右手掌腫脹無好轉并前臂稍紅腫，夜間疼痛不能安睡，感染控制欠佳，后細菌培養(yǎng)經(jīng)靶向DNA鑒定為克羅彭斯特諾卡菌，依據(jù)《熱病》[3]調整抗菌藥，口服大劑量磺胺甲基異惡唑，定時清洗引流術口，術口逐步愈合，出院后仍堅持服藥，定期隨防無復發(fā)。

2.2細菌表型特征

送檢的咖啡色膿液直接涂片進行革蘭染色見大量白細胞及呈90°分枝角革蘭氏陽性分枝菌絲（見圖1），末端不膨大，遂又加染抗酸及弱抗酸涂片，結果抗酸染色菌體為陰性，弱抗酸染色菌體為陽性：大量白細胞藍色背景下呈90°分枝角的紅色分枝菌絲[4-5]（見圖2）。

圖1　膿液涂片，克羅彭斯特諾卡菌（革蘭染色×1000）

圖2　膿液涂片，克羅彭斯特諾卡菌 （改良抗酸染色×1000）

35℃需氧培養(yǎng)48h后，在血平板及巧克力平板上可見較純細小菌落，白色粗顆粒樣，表面干燥，無溶血現(xiàn)象，時間延長則菌落出現(xiàn)淡黃色且起皺褶，表面出現(xiàn)粉狀菌絲，堆疊如皮革樣（血平板上較平坦少皺褶，見圖3；巧克力平板及普通瓊脂較多皺褶，見圖4），但無嵌入培養(yǎng)基內現(xiàn)象，整個菌落不易乳化，菌落涂片后菌體形態(tài)結果與膿液直接涂片圖1、圖2一致，菌落有輕微泥土氣息。在麥康凱培養(yǎng)基不長，在液體培養(yǎng)基生長形成白色菌膜，浮于液面，不易乳化，液體澄清。

圖3　克羅彭斯特諾卡菌 SBA6d

圖4　克羅彭斯特諾卡菌 巧克力平板6d

2.3普通生化反應

酶（+）、葡萄糖（+）、七葉苷（+）、甘露醇（-）、肌醇（-）、明膠（-）、尿素酶（+）。

該菌的這些種種形態(tài)學特征、菌落生化特性，高度懷疑為諾卡菌。

2.4質譜分析

對該分離疑為諾卡菌的菌株本實驗室無相應的配套板條鑒定，做質譜，質譜鑒定不出，原因可能是因為質譜庫里邊缺少這些少見菌菌株信息，有待完善。

2.516S rRNA擴增后測序

由于本微生物室條件有限，對實驗室分離疑為諾卡菌的菌株，上送廣州金域檢驗做靶向DNA測序鑒定細菌，通過16S rRNA基因擴增后，在約1500pb處可見單一清晰目的條帶，再用ABI公司的3730XL測序儀檢測，產(chǎn)物序列片段結果經(jīng)NCBI（National Center of Biotechnology Information ，美國國家生物技術信息中心）的BLAST進行同源性比對，與克羅彭斯特諾卡菌（GenBank No.DQ157924.2）的同源性達100%，說明擴增片段為目的基因。

3　討論

諾卡菌存在于土壤等自然環(huán)境中，為腐生性，為臨床不常見病原菌。主要由呼吸道、手術、外傷病原菌侵入機體，引起化膿性感染或肉芽腫性疾病，好發(fā)于肺部、足[6]和腿部（局限型），尤其對免疫力低下者易形成感染，感染后可播散到全身及中樞神經(jīng)系統(tǒng)（播散型）。一般局限者預后佳，播散型者預后差，死亡率高，有報道諾卡菌顱內感染死亡率為100%，肺部感染為41%，播散性感染為64%[7]。Nocard于1888年首次鑒定出諾卡菌，國內自1964年以來陸續(xù)有報道，近年來諾卡菌病呈上升趨勢。我國諾卡菌病患者的老年人數(shù)量較多[8]，隨著逐漸進入老年化社會，發(fā)病率也越來越高，這與老年人免疫功能低下相關。本病例也是一位老年人，原始病灶是手，國內外罕見報道，經(jīng)靶向DNA測序鑒定的克羅彭斯特諾卡菌，國內外也鮮見報道，因為此菌株是2014年新入庫NCBI的諾卡菌種，分離自肺移植患者肺部感染標本[9]。

諾卡菌隸屬于細菌域、放線菌綱、放線菌亞綱、放線菌目、棒桿菌亞目、諾卡菌科（Nocardiaceae），目前屬內有89種[7]。諾卡菌屬革蘭染色陽性或不定，不形成芽孢、無鞭毛。改良抗酸染色為弱陽性，原始標本直接涂片?？梢娋哂性\斷意義的呈90°分枝角的菌絲。培養(yǎng)為嚴格需氧菌，營養(yǎng)要求不高，在普通瓊脂培養(yǎng)基、沙保羅瓊脂即可緩慢繁殖生長，初代分離常需孵育一周，在室溫或35℃普通培養(yǎng)基上培養(yǎng)24～48h才能看到針尖大小的菌落，并常會被一些其他普通大菌落覆蓋，在常規(guī)檢驗中很容易被遺漏，需要與原始標本涂片（特別是痰涂片）及臨床（懷疑諾卡菌）相結合，所以接收到標本時建議在常規(guī)接種的同時涂片，在顯微鏡下見到G+桿菌呈分枝狀或革蘭氏染色著色不均勻的絲狀菌時，需要高度懷疑并延長標本培養(yǎng)時間觀察，否則容易造成漏診。培養(yǎng)三到四天該菌屬菌落表面干燥白色，或淡黃色，且該菌屬在不同培養(yǎng)基或不同時間菌落形態(tài)差異很大[4]（見圖3 ～ 4），不溶于生理鹽水（不易乳化），還可見淡黃色粗顆粒邊緣嵌入培養(yǎng)基中（俗稱咬瓊脂），但本病例中的克羅彭斯特諾卡菌例外（沒咬瓊脂現(xiàn)象）。

另外，諾卡菌在生長和形態(tài)上的特點與非結核分枝桿菌（nontuberculosis mycobacteria，NTM）及鏈霉菌很相似，臨床上肺部諾卡菌病與肺部結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）病癥狀相似，容易引起誤診[10]，主要區(qū)別在于結核分支桿菌普通抗酸染色法抗酸性強，鹽酸乙醇不易脫色，諾卡菌抗酸染色弱陽性，易被鹽酸乙醇脫色[11]，用弱抗酸染色法可以區(qū)分諾卡菌屬與分枝桿菌屬。諾卡菌與鏈霉菌的區(qū)別見表1。

表1　諾卡菌與鏈霉菌匠鑒別要點

諾卡菌因為其生化反應不典型，臨床少見，生長緩慢，導致傳統(tǒng)的分類、鑒定方法（形態(tài)學、生化反應）可靠性不強，而且鑒定此菌種耗時費力、低效，難以滿足臨床需求。近幾年新興的質譜分析法暫還只能覆蓋常見菌種，而少見菌種等信息不夠齊全，仍有待完善，因此，最受矚目的仍然是遺傳學——分子生物學的診斷方法[12]，如靶向DNA測序（16S rRNA基因擴增）鑒定。細菌16S rRNA的相對分子量大小適中，約1500bp，適合序列分析，又因其含有對所有細菌種及可變區(qū)的廣泛區(qū)段[13]，因此16S rRNA基因成為細菌系統(tǒng)分類鑒定的理想靶序列，也廣泛被細菌學家和分類學家接受和使用[14]。所以在DNA序列分析中，16S rRNA最常用于鑒定細菌的種，可以快速、簡便、特異性好，準確地診斷諾卡菌到種，也是目前對克羅彭斯特菌諾卡菌這些臨床少見菌的鑒定、檢測和新菌種發(fā)現(xiàn)方面最可靠的方法之一[1]。

本例患者為手局部感染，臨床醫(yī)生根據(jù)《熱病》[3]建議，首選采用復方新諾明（TMP-SMX）治療、清創(chuàng)處理皮膚壞死組織，隨后患者病情好轉，局部感染癥狀減輕，鞏固治療后出院，定期隨防無復發(fā)?！稛岵　穂3]對于諾卡菌的治療首選藥物為磺胺類藥物，但磺胺類藥物會引起不良反應包括胃腸道癥狀、皮膚癥狀、腎功能損害、肝毒性和骨髓抑制。尤其在艾滋病患者不良反應的發(fā)生率更高。所以對于磺胺類藥物過敏、發(fā)生嚴重不良反應、對磺胺類藥物耐受或治療失敗時的患者應更換其他敏感抗生素，如亞胺培南、利奈唑胺、阿米卡星、第三代頭孢菌素等進行治療。

綜上所述，實驗室可根據(jù)細菌形態(tài)學特征、菌落生化特性[15]結合遺傳學分析（16S rRNA基因擴增后做靶向DNA測序）鑒定諾卡菌屬，可及時、準確鑒定出克羅彭斯特諾卡菌這類生長緩慢、罕見細菌，對諾卡菌病的確診、治療、預后有著重大意義。

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The identification on an uncommon infection of Nocardia Kroppenstedtii in hand

ZHOU Shijuan
Huidong County People's Hospital,Huidong 516300,China

Objective To explore the method to identify the rare Nocardia Kroppenstedtii. Methods After isolating a strain from a patient’s hand, the method of combining bacterial morphology, colony biochemical characteristics analysis, genetic analysis (such as mass spectrometry, sequencing targeting DNA after 16S rRNA gene amplification) etc. were used for the identification. Results Observed through microscope,the rare bacteria by the clinical isolates had typical cell feature (the result of Gram stain shows 90° branching angle and G+branching hyphae and improved Kinyoun staining shows positive result),slow growth in blood agar and chocolate plate, small colonies, extended time to fold, catalase positive, breakdown of glucose, Esculin, urease, not broken down mannitol, inositol, gelatin. Then a comprehensive analysis included targeting DNA sequencing after 16S rRNA gene amplification was analyzed, and it was finally identified as Nocardia Kroppenstedtii. Conclusion Morphology observation, colony sublimation characteristic analysis and genetic analysis (such as sequencing targeting DNA after 16S rRNA gene amplification) any laboratory can identify Nocardia and can quickly, accurately identify Nocardia Kroppenstedtii, which is a type of rare strain with slow growth.

16S rRNA;Sequencing;Nocardia Kroppenstedtii

R446.5

B

2095-0616（2016）18-221-04

廣東省惠州市科技計劃項目（20160806）。

（2016-07-14）