谷胱甘肽過氧化物酶3甲基化及蛋白表達在胃癌中的臨床意義

范紅云 李 超 褚茜茜 段志英 韓雙雙 于衛(wèi)芳

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院消化內(nèi)科，河北 石家莊 050031)

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谷胱甘肽過氧化物酶3甲基化及蛋白表達在胃癌中的臨床意義

范紅云 李 超1褚茜茜1段志英 韓雙雙1于衛(wèi)芳1

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院消化內(nèi)科，河北 石家莊 050031)

目的 探討血漿谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)3基因啟動子甲基化及GPX3蛋白表達在胃癌發(fā)病中的臨床意義。方法 采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)方法檢測胃癌組和胃炎組血標(biāo)本中的GPX3甲基化程度；采用免疫組化方法檢測胃癌組和癌旁正常組織標(biāo)本中的GPX3蛋白表達情況，分析其與臨床病理特征間的關(guān)系。結(jié)果 ①胃癌組GPX3甲基化程度顯著高于胃炎組(P<0.01)；胃癌伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組GPX3甲基化程度顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)；胃癌組GPX3甲基化程度與患者年齡、性別和腫瘤分化程度、浸潤情況、TNM分期無關(guān)(P>0.05)；②胃癌組GPX3蛋白表達較癌旁正常組顯著降低(P<0.01)；胃癌伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組GPX3蛋白表達顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)；胃癌組GPX3蛋白表達與患者年齡、性別和腫瘤分化程度、浸潤情況、TNM分期無關(guān)(P>0.05)；③胃炎組GPX3蛋白表達與癌旁正常組無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論 GPX3基因啟動子區(qū)高甲基化通過下調(diào)GPX3蛋白表達，參與胃癌發(fā)生和促進淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，有潛力成為診斷胃癌、判斷預(yù)后的預(yù)警分子指標(biāo)和臨床治療中的基因調(diào)控靶點。

胃癌；谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)3；甲基化；蛋白；甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)；免疫組化

2012年中國腫瘤登記年報數(shù)據(jù)中，胃癌占惡性腫瘤發(fā)病率的第二位和死亡率的第三位〔1〕。研究表明，DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳機制，通過下調(diào)抑癌基因表達在胃癌的發(fā)病過程中起重要作用。血漿谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)3是機體抗過氧化物酶防御體系中的重要成員，能夠?qū)C體內(nèi)過多的活性氧及過氧化物分解為無害的水，降低其對細胞DNA的損害〔2,3〕。本實驗分析GPX3基因啟動子區(qū)甲基化程度及GPX3蛋白表達情況與胃癌臨床病理特征間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012～2014年我院消化內(nèi)科患者70例分為胃癌組35例，均為普外科行胃切除手術(shù)的患者，術(shù)前均未接受過放療或化療，其中男21例，女14例，年齡45～80歲，平均(65.65±4.34)歲。慢性胃炎組35例，均來自消化內(nèi)科和內(nèi)鏡中心，其中男18例，女17例，年齡35～75歲，平均(60.35±4.54)歲。兩組性別及年齡無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

1.2 血標(biāo)本采集 抽取全血標(biāo)本后立即于液氮罐轉(zhuǎn)運，然后存放于-80℃冰箱儲存待進一步檢測。

1.3 組織標(biāo)本采集 胃癌組分別取癌灶中央非壞死區(qū)域標(biāo)本及與之配對的距離癌組織5 cm以上的區(qū)域作為癌組織標(biāo)本及癌旁組織標(biāo)本。慢性胃炎組通過胃鏡活檢留取胃黏膜組織標(biāo)本。入選組織標(biāo)本均經(jīng)病理診斷證實。

1.4 GPX3基因啟動子區(qū)甲基化的測定 按照OMEGA公司DNA提取試劑盒說明書對各組血標(biāo)本提取DNA，然后對所提取DNA進行亞硫酸氫鹽處理，再用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)處理結(jié)束后，所得產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，待DNA條帶分離后于凝膠成像系統(tǒng)下拍照，分析實驗結(jié)果。

1.5 GPX3蛋白表達的測定 石蠟標(biāo)本連續(xù)切片后分別行蘇木素-伊紅(HE)染色、GPX3抗體免疫組織化學(xué)染色。采用雙盲法分析顯微鏡下觀察結(jié)果〔4〕：GPX3蛋白為細胞質(zhì)棕黃色為陽性，不著色為陰性。陽性判定以陽性細胞數(shù)及染色強度綜合判定。陽性細胞百分比計分按視野內(nèi)陽性細胞所占總細胞數(shù)的比例，<5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分；染色強度不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。每張切片隨機取5個400倍視野，二者相加，≤3分為陰性，>3分為陽性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌組與胃炎組血標(biāo)本中GPX3甲基化程度的比較 胃癌組23例甲基化(65.71%)；胃炎組10例甲基化(28.57%)，差異顯著(χ2=9.689，P=0.002)。

2.2 GPX3甲基化與胃癌臨床病理特征的關(guān)系 見表1。胃癌伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中GPX3甲基化率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)。GPX3甲基化程度與患者年齡、性別和胃癌的病理分化程度、浸潤情況、TNM分期無關(guān)(P>0.05)。

2.3 胃癌及癌旁正常組織標(biāo)本中GPX3蛋白表達的比較 胃癌組GPX3蛋白陽性表達(13/35，37.15%)明顯低于癌旁正常組(23/35，65.71%)(χ2=5.719，P=0.015)。

2.4 GPX3蛋白表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系 GPX3蛋白表達在胃癌伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間差異顯著(P=0.042)。GPX3蛋白表達與患者年齡、性別和胃癌分化程度、浸潤情況、TNM分期等均無關(guān)(P>0.05)，見表2。

表1 GPX3甲基化陽性與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系〔n(%)〕

表2 GPX3蛋白表達與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系〔n(%)〕

2.5 胃炎組及癌旁正常組中GPX3蛋白表達的比較 慢性胃炎組中GPX3蛋白陽性表達(26/35，74.29%)與癌旁正常組(23/35，65.71%)無明顯差異(χ2=0.612，P=0.301)。

3 討 論

GPX3表達異常與前列腺癌〔5〕、卵巢癌〔6〕、食管癌〔7,8〕、胃癌〔9〕、結(jié)腸癌〔10〕等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在密切聯(lián)系，并提示其與GPX3基因啟動子區(qū)高甲基化有關(guān)。本實驗提示GPX3基因甲基化與胃癌發(fā)生存在一定的關(guān)聯(lián)性。Wang等〔11〕指出，GPX3作為一個新被發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，能夠在體內(nèi)外實驗中激活P53可誘導(dǎo)基因(PIG)3，誘發(fā)細胞凋亡而發(fā)揮抑癌作用。據(jù)此推測，胃癌中的GPX3基因啟動子區(qū)高甲基化可能通過下調(diào)該抑癌基因的表達發(fā)揮促癌作用。Peng等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)，胃癌中GPX3基因啟動子CpG島呈現(xiàn)高甲基化，而在正常胃組織中甲基化程度明顯下降，與本實驗結(jié)果類似。本組結(jié)果提示GPX3啟動子區(qū)的高甲基化促進了胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，有潛力成為判斷胃癌進展和預(yù)后的預(yù)警分子指標(biāo)。Peng等〔9〕研究指出，胃癌GPX3的甲基化表達越高，其發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的概率就越大。另據(jù)多項研究表明，多種miRNA的啟動子區(qū)存在高甲基化現(xiàn)象，并與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔12～15〕。

本文結(jié)果說明GPX3蛋白在控制胃腺體細胞惡變轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用。推測相關(guān)機制是，GPX3基因啟動子區(qū)高甲基化導(dǎo)致機體細胞中GPX3蛋白表達下調(diào)，其對過氧化物和活性氧自由基的清除能力隨之下降，活性氧自由基的堆積加劇了對細胞DNA的損害，導(dǎo)致基因斷裂、突變等一系列變化，促進機體細胞發(fā)生惡變〔16〕。GPX3在多種人類上皮來源惡性腫瘤中的表達降低，參與腫瘤的發(fā)病〔17,18〕。本研究結(jié)果提示GPX3蛋白在控制胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了一定的作用。Min等〔19〕研究指出，GPX3的缺失或低表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在一定的相關(guān)性，與本實驗結(jié)果一致。

綜上，GPX3通過啟動子區(qū)甲基化導(dǎo)致GPX3蛋白下調(diào)，使機體抗氧化能力下降，導(dǎo)致細胞DNA的損傷，從而促進胃癌的發(fā)生，參與胃癌的進展過程，其有潛力成為診斷胃癌、判斷預(yù)后的預(yù)警分子指標(biāo)，為胃癌臨床治療提供了新的基因調(diào)控靶點。

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〔2015-01-19修回〕

(編輯 苑云杰)

于衛(wèi)芳(1973-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤研究。

范紅云(1975-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事胃腸病研究。

R735.3

A

1005-9202(2016)22-5634-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.064

1 河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)鏡中心