瀘州地區苗族人群CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因多態性分析Δ

胡功利，王國俊，楊　婷，陳　竹，葉　云（西南醫科大學附屬醫院藥學部，四川瀘州　646000）

瀘州地區苗族人群CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因多態性分析Δ

胡功利＊，王國俊#，楊婷，陳竹，葉云（西南醫科大學附屬醫院藥學部，四川瀘州646000）

目的：研究瀘州地區苗族人群細胞色素P450（CYP）2C19、三磷酸腺苷結合盒亞家族B成員1（ABCB1）、CYP3A4和CYP3A5的基因型和基因型頻率。方法：采用拋擲硬幣法選擇四川省瀘州地區無直接血緣關系的健康苗族受試者54例，采用反轉錄-聚合酶鏈反應法對其CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因進行擴增，擴增產物經檢測、測序后，采用Chromas 2軟件對其基因型進行比對分析，并對不同性別受試者CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因型頻率進行比較。結果：54例苗族受試者CYP2C19快代謝型（HomEM，*1*1基因型）、中代謝型（HetEM，*1*2或*1*3基因型）和慢代謝型（PM，*2*2、*2*3或*3*3基因型）頻率分別為20.37%、61.11%和18.52%；ABCB1 CC、CT和TT基因型頻率分別為29.63%、51.85%和18.52%；CYP3A4 GG、GA和AA基因型頻率分別為38.89%、53.70%和7.41%；CYP3A5 TT、TC和CC基因型頻率分別為81.48%、16.67%和1.85%；不同性別苗族受試者CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因型頻率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。結論：苗族受試者中CYP2C19 HetEM型和CYP3A4 G等位基因攜帶者的比例較高，ABCB1多態性位點的實變率較高，CYP3A5多態性位點的突變率較低；性別對瀘州地區苗族受試者CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因多態性的分布并無明顯影響。

基因多態性；反轉錄-聚合酶鏈反應法；苗族人群；瀘州地區；CYP2C19；ABCB1；CYP3A4；CYP3A5

藥物代謝與療效密切相關，影響藥物代謝的因素較多，主要包括基因多態性（Gene polymorphism）、藥物相互作用和飲食習慣等，其中基因多態性是其中非常重要的影響因素[1]。細胞色素P450（CYP）酶系是肝臟中的主要代謝酶之一，包括CYP2C19、CYP3A等藥物代謝酶。遺傳學的改變使CYP酶表現出多態性，且具有明顯的個體、種族或地域差異[2]。CYP2C19存在多種突變等位基因，*2、*3是其主要突變體，這2種突變等位基因均可導致CYP2C19酶活性的降低或完全喪失[3]。三磷酸腺苷結合盒亞家族B成員1（ATP-binding cassette subfamily B member 1；ABCB1）rs1045642（C3435T）多態性位點T等位基因可直接影響P糖蛋白（P-gp）的表達，進而影響藥物的藥動學特征[4]。CYP3A主要由CYP3A4和CYP3A5同工酶組成，CYP3A4（rs2242480）易感單核多肽位點ⅣS10+12G＞A可影響纖維蛋白原受體GPⅡb/Ⅲa的活性，攜帶ⅣS10+ 12G＞A者該受體活性下降，對血小板聚集的抑制作用增強[5]；CYP3A5（rs3800959）多態性位點是調控CYP3A5表達水平的主要方式，同時也可影響其代謝酶的活性，最終導致其代謝底物的能力和速率發生不同程度的改變，是造成個體、種族差異的重要原因[6]。

我國是一個多民族國家，苗族人口逐年上升[7-8]。目前，關于漢族人群CYP2C19基因多態性的研究報道較多，也有關于其ABCB1、CYP3A5基因多態性的相關報道[9-11]，但尚未見以苗族人群為研究對象的基因多態性研究。由于瀘州地區苗族人口眾多，分析該地區苗族人群CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因多態性的分布情況具有較大的臨床意義。本試驗以瀘州地區苗族人群為研究對象，探討其CYP2C19*2、CYP2C19*3、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5的基因多態性，為基因導向藥物的給藥方案提供參考。

1　資料與方法

1.1研究對象

采用拋擲硬幣法，選擇四川省瀘州地區無直接血緣關系的健康苗族人群，硬幣正面朝上者則納入研究，如有受試者拒絕參與應盡量說服。最終納入苗族受試者54例，其中男性32例，女性22例，平均年齡（49.8±16.5）歲。本研究方案經醫院醫學倫理委員會批準，各受試者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2材料

PTC2150型聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國MJ Research Inc公司）；JM2250型電泳儀（北京宏康公司）。

基因組DNA提取試劑盒（批號：DP130227）、DNA Marker（批號：B1101A）均購自天根生化科技（北京）有限生物公司；2× Taq PCR MasterMix（批號：715676BD）、ddH2O（批號：706767XD）均購自北京博邁德基因技術有限公司；2%瓊脂糖凝膠購自上海生工生物工程技術服務有限公司，批號：142060。

1.3引物設計與合成

參照文獻[9-11]中CYP2C19*2、CYP2C19*3、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因的特異性引物序列（見表1），由大連寶生物公司合成。

1.4基因組DNA提取

表1　CYP2C19*2、CYP2C19*3、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因引物序列Tab 1Primer Sequences of CYP2C19*2、CYP2C19*3、ABCB1、CYP3A4and CYP3A5

于空腹狀態下，抽取各受試者肘部靜脈血3 ml，按照基因組DNA提取試劑盒說明書操作，提取受試者的DNA，將產物放置于－20℃冰箱中冷凍保存，備用。

1.5基因型檢測

采用反轉錄-聚合酶鏈反應（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法分別擴增血液樣本中CYP2C19*2、CYP2C19*3、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因。反應體系共50 μl，包括DNA產物6 μl，上、下游引物各1.5 μl，2×Taq PCR MasterMix 25 μl，ddH2O 16 μl。擴增條件：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，72℃再延伸5 min，共進行35個循環。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性產物由上海生工生物工程技術有限公司測序，并利用Chromas 2軟件（http：//www.seekbio.com/DownloadShow.asp?id=284）對序列進行比對分析，確定其基因型。

1.6代謝表型的定義[12]

根據不同CYP2C19基因型將其代謝類型分為3類：*1*1基因型為681GG和636GG，屬于快代謝型（HomEM）；*1*2基因型為681GA和636GG，*1*3基因型為681GG和636GA，屬于中代謝型（HetEM）；*2*2基因型為681AA和636GG，*2*3基因型為681GA和636GA，*3*3基因型為681GG和636AA，屬于慢代謝型（PM）。

1.7統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計、分析。采用χ2檢驗判斷多態性位點的基因型頻是否符合Hardy-Weinberg平衡（HWE），P＞0.05為符合HWE；采用χ2檢驗或Fisher’s檢驗比較不同性別受試者各基因型頻率的差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1PCR產物檢測結果

以各受試者基因組DNA為模板，對其CYP2C19*2、CYP2C19*3、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因進行特異性PCR擴增，產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后，均顯示出清晰條帶（見圖1），提示擴增和測序的成功率均為100%。

圖1　CYP2C19*2、CYP2C19*3、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5擴增產物電泳結果M.DNA Marker；1.CYP2C19*2擴增產物（321 bp）；2.CYP2C19*3擴增產物（271 bp）；3.ABCB1擴增產物（452 bp）；4.CYP3A4擴增產物（420 bp）；5.CYP3A5擴增產物（493 bp）Fig 1　Electrophoresis for PCR products of CYP2C19*2，CYP2C19*3，ABCB1，CYP3A4and CYP3A5M.DNA marker；1.the product of CYP2C19*2（321 bp）；2.the product of CYP2C19*3（271 bp）；3.the product of ABCB1（452 bp）；4.the product of CYP3A4（420 bp）；5.the product of CYP3A5（493 bp）

2.2HWE檢驗

χ2檢驗結果顯示，CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因型頻率的觀察值和理論值吻合度良好，其分布均符合HWE（P＞0.05），表明所選受試者具有良好的群體代表性。54例苗族受試者CYP2C19、ABCB1、CYA3A4和CYP3A5基因型分布見表2。

表254　例苗族受試者CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CPY3A5基因型分布[例（%%）]Tab 2　Distribution of CYP2C19，ABCB1，CYP3A4 and CYP3A5 genotype in 54 Miao population volunteers [case（%%）]

由表2可見，54例苗族受試者中CYP2C19、HetEM型和CYP3AG等經基因攜帶者的比例較高，ABCB1為態性位點的突變率較高，CYP3A4多態性位點的突變率較低。

2.3不同性別苗族受試者CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因型比較

54位苗族受試者CYP2C19 HomEM、HetEM、PM型頻率分別為20.37%、61.11%、18.52%；ABCB1 CC、CT、TT基因型頻率分別為29.63%、51.85%、18.52%；CYP3A4 GG、GA、AA基因型頻率分別為38.89%、53.70%、7.41%；CYP3A5 TT、TC、CC基因型頻率分別為81.48%、16.67%、1.85%，各基因型的男性和女性各基因型頻率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。不同性別苗族受試者基因型頻率比較見表3。

表3　不同性別苗族受試者基因型頻率比較[例（%%）]Tab 3　Comparison of genetic frequency among Miao population volunteers with different gender[case（%%）]

3　討論

我國是一個多民族國家，6次人口普查結果顯示，我國苗族人口分別為215萬（1953年）、278萬（1964年）、503萬（1982年）、739萬（1990年）、894萬人（2000年）和942萬（2010年），呈逐年增長趨勢；至2010年，苗族人口總數已躍居中國少數民族人口總數的第6位[7-8]。瀘州是一個多民族散雜居地區，全市共有46個少數民族，少數民族人口7.22萬人，其中苗族人口最多，為5.57萬人，占瀘州地區少數民族的絕大部分。各民族在遺傳背景大致相似的情況下又各有民族特色，特殊的地理環境和生活習慣可能會導致苗族人群某些基因代謝類型發生改變[13]。因此，研究其基因多態性分布情況，可為初步了解苗族人群藥動學特征、開展個體化給藥提供參考。

CYP2C19含490個氨基酸殘基，CYP2C19*2（rs4244285，681G＞A）變異，會導致翻譯過程中產生1個異常的剪接位點，從而生成1個簡短的無功能蛋白質；CYP2C19*3（rs4986893，636G＞A）變異，會導致在此位置產生1個異常的終止密碼子，最終合成無功能蛋白質[9]。這2種無功能的蛋白質均可使經該酶代謝的藥物在體內代謝受阻。因此，CYP2C19基因多態性的改變，使其呈現為HomEM、HetEM和PM等3種代謝型，最終影響藥物在體內的代謝速率。本研究結果顯示，CYP2C19 HomEM、HetEM和PM型頻率分別為20.37%、61.11%和18.52%，表明在苗族受試者中，大部分為CYP2C19 HetEM型，存在少數HomEM型和PM型，這與我國漢族人群CYP2C19基因多態性分布的差異較大（漢族人群CYP2C19 HomEM、Het-EM和PM型頻率分別為46.67%、36.67%和16.67%）[9]。提示當苗族患者使用經CYP2C19酶代謝的藥物時，臨床應重視個體化用藥。

ABCB1基因位于人類7號染色體q21.1，包含28個外顯子，片段大小在49～209個堿基對之間，轉錄得到的mRNA大小為4.5 kb[14]。ABCB1基因C3435T基因多態性位點可通過改變密碼子的選擇和使用進而影響蛋白質折疊結構，該位點可通過密碼子的替換調節翻譯速度或節奏，最終導致P-gp局部的細微結構變化，進而影響其對各種調節分子或底物的親和力[10]。如：在使用氯沙坦治療高血壓時，攜帶ABCB1（C3435T）T等位基因的患者對氯沙坦有更好的應答效果[15]。本研究結果顯示，ABCB1基因CC、CT和TT基因型頻率分別為29.63%、51.85%和18.52%，表明在苗族受試者中，ABCB1 C3435T多態位點存在較高的突變率，其代謝頻率分布與漢族人群分布大致相同（漢族人群ABCB1 CC、CT和TT基因型頻率分別為33.4%、44.8%和21.8%）[10]。

CYP3A是CYP的主要亞家族，其重要成員有CYP3A4和CYP3A5。改變CYP3A表達水平的主要調控方式是基因多態性，通過影響其代謝酶活性，最終改變對底物的代謝能力和速率，是導致臨床用藥出現個體差異的重要因素[16]。CYP3A4基因位于染色體7q21.3～22.1，全長27 kb，包含了13個外顯子和12個內含子，且其活性受基因表達水平的調控。研究發現，CYP3A4（ⅣSl0+12G＞A）A等位基因可增加相關酶的活性，并增強相關藥物代謝的敏感性[11]。本研究結果顯示，CYP3A4 GG、GA和AA基因型頻率分別為38.89%、53.70%和7.41%，表明在苗族受試者中，CYP3A4基因大多屬于GA基因型，與漢族人群CYP3A4的基因型分布存在較大差異（漢族人群CYP3A4 GG、GA和AA型的頻率分別為58.00%、37.88%和4.12%）[17]。提示當苗族患者使用以CYP3A4基因為導向的藥物時，臨床應特別注意藥物代謝的差異，及時調整用藥劑量。CYP3A5基因位于人類第7號染色體，全長31.8 kb，共編碼502個氨基酸。該基因在10%～97%的人群中表達，其活性占體內CYP3A總活性2%～60%，表達呈多態性，被認為是個體間CYP3A活性差異的最主要因素[10]。本研究結果顯示，CYP3A5 TT、TC和CC基因型頻率分別為81.48%、16.67%和1.85%，表明絕大部分苗族受試者攜帶CYP3A5 T等位基因，與漢族人群CYP3A5基因型分布相似（漢族人群CYP3A5 TT、TC和CC基因型頻率分別為73.38%、24.75%和1.87%）[11]。

少數基因多態性分布與性別具有相關性，如：多巴胺D3受體（DRD3）基因Ser9Gly多態性與精神分裂癥患者工作記憶障礙具有相關性，具體表現為：攜帶Ser純合子者工作記憶較差，且女性人群中Ser純合子的頻率高于男性，是女性人群患精神分裂癥的重要因素之一[18]。本研究初步探討了CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因在不同性別苗族受試者中分布的差異。研究結果顯示，性別對于瀘州地區苗族人群CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因型分布均無顯著影響（P＞0.05），與劉杰等[19]的研究結果相似。提示當苗族患者在使用以上述基因為導向的藥物時，臨床無需特別注意不同性別間的差異。

目前尚無苗族人群CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因型和基因型頻率的相關研究報道。本研究以無血緣關系的54例健康苗族受試者為對象，采用RT-PCR法對其CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因進行擴增，擴增產物經檢測、測序后，應用Chromas 2軟件對其基因型進行比對分析，初步探討苗族人群各基因型的分布情況。結果顯示，瀘州地區苗族受試者中CYP2C19 HetEM型和CYP3A4 G等位基攜帶者的比例較高，ABCB1多態性位點的突變率較高，CYP3A5多態性位點的突變率較低；性別對其CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因多態性的分布無明顯影響。但本研究受試驗條件的限制，研究樣本量有限，因此以上研究結果尚需擴大樣本量進一步驗證。

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（編輯：張元媛）

Genetic Polymorphism Analysis of CYP2C19，ABCB1，CYP3A4 and CYP3A5 in Miao Population from Luzhou

HU Gongli，WANG Guojun，YANG Ting，CHEN Zhu，YE Yun（Dept.of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Sichuan Luzhou 646000，China）

OBJECTIVE：To study the genotype and genetic frequency of cytochrome P450（CYP）2C19，ATP-binding cassette subfamily B member 1（ABCB1），CYP3A4 and CYP3A5 in Miao population from Luzhou.METHODS：A total of 54 Miao population healthy volunteers without direct sibship were randomly selected from Luzhou area in Sichuan province by coins toss.RTPCR was used to amplify CYP2C19，ABCB1，CYP3A4 and CYP3A5.PCR products were detected and sequenced.Chromas 2 software was used to analyze the genotypes，and compare genetic frequency of CYP2C19，ABCB1，CYP3A4 and CYP3A5.RESULTS：For CYP2C19，the frequencies of HomEM（*1*1 genotype），HetEM（*1*2 or*1*3 genotype）and PM（*2*2，*2*3 or* 3*3 genotype）were 20.37%，61.11%and 18.52%in 54 Miao population volunteers.For ABCB1，the frequencies of CC，CT and TT genotype were 29.63%，51.85%and 18.52%，respectively.For CYP3A4，the frequencies of GG，GA and AA genotype were 38.89%，53.70%and 7.41%，respectively.For CYP3A5，the frequencies of TT，TC and CC genotype were 81.48%，16.67%and 1.85%，respectively.There was no significant differences in genetic frequency of CYP2C19，ABCB1，CYP3A4 and CYP3A5 among Miao population volunteers with different gender（P＞0.05）.CONCLUSIONS：There are high percent about CYP2C19 Het-EM and CYP3A5 G allele in Miao population，high mutation rate of ABCB1 polymorphic site，and low mutation rate of CYP3A5 polymorphic site.Gender have no significant effect on the polymorphism of CYP2C19，ABCB1，CYP3A4 and CYP3A5 in Miao population from Luzhou area.

Genetic polymorphisms；RT-PCR；Miao population；Luzhou area；CYP2C19；ABCB1；CYP3A4；CYP3A5

R969.1；R968

A

1001-0408（2016）32-4473-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.32.03

瀘州市科技計劃項目（No.2013-S-48）

＊碩士研究生。研究方向：臨床藥學。電話：0830-3165750。E-mail：807080229@qq.com

主任藥師，碩士。研究方向：臨床藥學。電話：0830-3165750。E-mail：wanggj7532@163.com

（2016-07-22

2016-08-29）