香菇多酚氧化酶活性測定方法的改進

黃赫雁，韓春然，李 煜，戴傳榮，林樅雨，張家成

（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱 150076）

香菇多酚氧化酶活性測定方法的改進

黃赫雁，*韓春然，李 煜，戴傳榮，林樅雨，張家成

（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱 150076）

對目前香菇多酚氧化酶活性的測定方法進行改進，通過離心消除蛋白質沉淀對反應的不利影響，以及其他因素對酶活力測定的影響，并對該方法進行了重復與再現試驗。結果表明，香菇中多酚氧化酶的最佳測定條件為反應液預熱溫度40℃，添加質量分數20%（W/V）的三氯乙酸，取酶液1 mL，添加濃度0.3 mol/L的鄰苯二酚，反應3 min后進行離心，于波長410 nm處測定吸光度。穩定性與再現性試驗表明，此方法的重復試驗和再現試驗的相對標準偏差性均小于5%。

香菇；多酚氧化酶；分光光度法；改進；離心

0 引言

多酚氧化酶是導致香菇酶促褐變的主要酶類，引起香菇變黑甚至腐爛，導致品質下降。該酶往往催化香菇中的內源性多酚物質氧化為醌類化合物，醌類化合物使高活性親電子的分子能夠聚合，導致褐色或黑色色素的形成，嚴重影響產品的營養價值、風味等[1-2]。多酚氧化酶活性常用的檢測方法為分光光度法，該法利用鄰苯二酚和D-兒茶素在多酚氧化酶（PPO）催化下生成有色產物，其顯色物質在波長410 nm處有最大吸收，吸收值在單位時間內的變化和單位酶活性成正比，依此計算PPO活性強度。測定具有操作簡單、準確性好等特點，應用范圍較廣[3]。按照反應時間，分光光度法測定酶活又可分為連續監測法和定時法兩大類。連續監測法是目前果蔬中PPO活性測定常用方法，這種方法可將多點的測定結果連接成線，很容易找到呈直線的區段，因而可以選擇線性反應期來計算酶活性，但香菇中多酚氧化酶的線性反應期只出現在反應開始時的極短時間區域內，因此操作復雜，對試驗人員的操作速度要求較高，誤差較大。在參考ünal M ü等人[4-5]的方法，以鄰苯二酚為底物，采用分光光度法測定香菇多酚氧化酶活性時發現，該方法測定的分光光度值數值小且不穩定，出現了測定的分光光度值隨時間增加而減小，與實際趨勢不一致的現象。其原因為多酚氧化酶與底物接觸既反應，且僅在反應開始的短時間內呈線性增加，因此需要操作迅速，并且該方法在連續監測的情況下需要對分光光度計進行保溫。蘇適等人[6]在測定香菇中多酚氧化酶活性時，對此法進行了改進，采用分光光度法，使用了三氯乙酸來終止反應，方法簡單，測定時酶促反應已經被終止，故分光光度計無需保溫設備。另外，有文獻提到使用其他方法終止反應，如沸水浴法[7]；但也有文獻指出，使用三氯乙酸終止酶反應較其他方法得出的試驗結果更加準確有效[8]。但該方法沒有測定反應開始時的分光光度值，無法知道在整個酶促反應進程中是否都是零級反應，而且作為蛋白質變性劑的三氯乙酸能夠使蛋白質構象發生改變，使蛋白質暴露出較多的疏水性基團，從而引起蛋白質聚集沉淀，這些絮狀沉淀嚴重影響分光光度值的測定。因此，在使用該方法時，第一需要測定反應開始時的分光光度值，第二有必要將沉淀與反應液分離開來，從而消除沉淀對分光光度值的影響。所以，在前面分光光度法的基礎上，使用三氯乙酸終止酶促反應后，對反應液進行離心，將沉淀分離，同時對方法中涉及到的其他對酶活測定有影響的因素（溫度、緩沖液pH值、三氯乙酸質量分數、酶液體積和底物濃度）進行探討，以期使香菇中多酚氧化酶活性的測定方法在簡單的基礎上更加準確、可靠。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇，采摘于哈爾濱玉豐菌業香菇生產基地；磷酸二氫鈉（分析純），天津市風船化學試劑有限公司提供；磷酸氫二鈉（分析純）、三氯乙酸（分析純），天津市致遠化學試劑有限公司提供；鄰苯二酚（教學試驗用），天津市巴斯夫化工有限公司提供；PVPP（分析純），廣東粵美化工有限公司提供。

1.2 主要儀器

TGL-18C型高速冷凍離心機，湖南星科科學儀器有限公司產品；UV-5200型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司產品；電子天平，上海光正醫療儀器有限公司產品；DK-98-11A型恒溫數顯水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 粗酶液的制備

取新鮮的香菇50 g，加pH值為6.9的2%PVPP的磷酸緩沖液50 mL，勻漿，攪拌，靜置40 min，以轉速8 000 r/min離心10 min。取上清液于4℃冰箱保存。

1.3.2 多酚氧化酶酶活計算

多酚氧化酶活力單位定義為在測定條件下，每毫升樣品每分鐘引起吸光度改變0.001，則定為1個酶活單位［U/(g·min)］，樣品中的多酚氧化酶活性按下式方程計算：

式中：R——多酚氧化酶活性，單位U/（g·min）；

ΔA——反應時間內吸光度的變化；

Vt——酶提取液的總體積，mL；

W——香菇的鮮質量，g；

Vs——參加反應的酶液體積，mL；

T——反應時間，min。

1.3.3 PPO活性測定的方法

（1）按參考文獻[1]方法。取1 mL濃度為0.1 mol/L鄰苯二酚，加入5 mL磷酸鹽緩沖液（pH值6.9），搖勻。在30℃條件下水浴恒溫10 min，立即加入1 mL酶溶液，快速搖勻。以不加酶液加入1 mL PBS溶液的反應體系為參比液，采用分光光度計于波長410 nm處測定溶液的吸光度。每30 s測定1次，共測定3 min。以1 mL酶液，1 min內增加的吸光度表示酶活力的大小。

（2）按參考文獻[2]方法。取1 mL濃度為0.1 mol/L鄰苯二酚，加入5 mL磷酸鹽緩沖液（pH值6.88），再加0.5 mL酶溶液作為反應體系，搖勻。在特定溫度條件下恒溫10 min，立即加入20%三氯乙酸2 mL，快速搖勻。以不加酶溶液的反應體系溶液為參比液，采用723型分光光度計于波長410 nm處測定溶液的吸光率（O.D）。此時吸光率（O.D）的數值就表示原酶溶液中酶活力。

（3）改進方法。將試管A加入5 mL pH值6.9的磷酸緩沖液，在40℃溫度下水浴10 min，40℃預熱的酶液1 mL，再加入1 mL質量分數為20%的三氯乙酸溶液使酶失活，然后加入1 mL濃度為0.3 mol/L鄰苯二酚，搖勻，以轉速8 000 r/min離心5 min，取上清液，于波長410 nm處測定溶液吸光度，此為反應開始時的數值。同時，以緩沖溶液替代酶液做相同處理，作為空白對照。再將試管B加入5 mL pH值6.9的磷酸緩沖液，0.3 mol/L鄰苯二酚1 mL，搖勻，在40℃溫度下水浴10 min，加入1 mL預熱的酶液同時開始計時，3 min后立即加入1 mL質量分數為20%的三氯乙酸溶液，以轉速8 000 r/min離心5 min，取上清液，采用分光光度計于波長410 nm處測定溶液的吸光度A2，此為反應終止時的數值。同時，以緩沖溶液替代酶液做相同處理，作為空白對照。其中ΔA=A2-A1。

1.3.4 離心對酶活性測定的影響

在對參考文獻[2]方法進行檢測的過程中發現，該法并未測定反應開始時的吸光度，并且反應液經過離心后顏色變淺，而沉淀顏色則變深，可見反應后再離心可能導致部分反應產物被沉淀帶走，因此有必要考察離心對PPO活性測定的影響。在此基礎上，添加另一支試管測定開始時吸光度，具體操作步驟：取一只試管加入5 mL pH值6.9的磷酸緩沖液，在30℃溫度下水浴10 min，30℃預熱的酶液1 mL，再加入1 mL質量分數為20%的三氯乙酸溶液使酶失活，然后加入0.1 mol/L鄰苯二酚1 mL，搖勻，以轉速8 000 r/min離心5 min，取上清液，于波長410 nm處測定溶液吸光度，此為反應開始時的數值A1。另取一支試管按照參考文獻[2]方法測定。當2支試管中的反應結束后，將試管內的液體以轉速8 000 r/min離心5 min，取上清液，進行測定。

1.3.5 其他因素對酶活測定的影響

（1）溫度對酶活性測定的影響。通過試驗發現測定時最適溫度并非是30℃，因此有必要考察改進方法中溫度對酶活測定的影響。設定預熱溫度分別為20，30，40，50，60℃。

（2）緩沖溶液的pH值對酶活測定的影響。考察測定方法中緩沖溶液的pH值對酶活測定的影響，設定緩沖溶液的pH值分別為6.7，6.8，6.9，7.0，7.1。

（3）三氯乙酸質量分數對酶活測定的影響。測定時三氯乙酸質量分數低，則酶并未完全失活；三氯乙酸質量分數過高會有安全隱患，因此有必要考查三氯乙酸使酶失活時的適宜質量分數。設定三氯乙酸質量分數（W/V）分別為15%，20%，25%，30%，35%。

（4）酶液體積對酶活測定的影響。考察測定方法中酶液體積對酶活測定的影響。設定酶液體積分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL。

（5）底物濃度對酶活測定的影響。考察測定方法中底物濃度對酶活測定的影響，設定鄰苯二酚濃度分別為0.1，0.2，0.3，0.4 mol/L。為了進一步研究底物濃度對酶促反應的影響，計算該酶的Km值和該酶促反應的Vmax值。以單位時間內單位體積的產物生成量來表示該酶促反應的速度，將1/V對1/[S]作圖，即可得到一條直線，該直線在Y軸上的截距即為1/Vmax，在X軸上的截距即為1/Km的絕對值。

1.3.6 改進方法的穩定性與再現性驗證

重復試驗為同一實驗室，同一操作人員按照改進方法，連續3 d測試香菇中多酚氧化酶活性；再現試驗為不同實驗室，另一位操作人員按照改進方法，連續3 d測試香菇中多酚氧化酶活性。

1.3.7 改進方法在其他果蔬中的應用

考察改進方法在其他果蔬中的應用，選取香蕉、馬鈴薯、金針菇進行穩定性試驗。在同一實驗室，同一操作人員按照改進方法，連續3 d測試香菇中多酚氧化酶活性。

2 結果與分析

2.1 參考文獻[1]方法的驗證

吸光度隨時間的變化見圖1。

此方法測定PPO活性時，吸光度在3 min內變化較小，誤差大且不穩定，由于PPO與底物接觸立即反應，且在反應開始的短時間內呈線性增加，因此需要操作迅速，但仍無法準確確定反應開始時的分光光度值，因此該方法誤差較大。

圖1 吸光度隨時間的變化

2.2 離心對PPO活性測定的影響

離心對PPO活性測定的影響見圖2。

圖2 離心對PPO活性測定的影響

由圖2可知，未離心時測定的酶活性數值為負數，顯然與事實不符。出現這種現象的原因為，測定反應開始時吸光度大于測定反應終止時的吸光度。造成這樣的結果可能是三氯乙酸的添加與溶液中某些物質相結合，結合后的物質影響多酚氧化酶氧化底物的生成物對紫外光的吸收，而使得測定反應終止時吸光度變小。進行離心后，結果有了明顯的改變，證明離心對三氯乙酸與某些物質結合形成的不溶物有明顯影響。但是，這種結合而成的物質是通過什么方式以及如何影響PPO氧化底物的生成物對紫外光的吸收還需要進一步研究。

溫度對PPO活性測定的影響見圖3。

圖3 溫度對PPO活性測定的影響

由圖3可知，隨著溫度的升高，酶活性逐漸增大，考慮為隨著溫度的升高，溶液中分子的熱運動加劇，單位時間內底物與酶接觸的幾率增高，酶活性增大；繼續升高溫度，酶活性逐漸降低，考慮為隨溫度升高酶蛋白變性也增加，酶活性降低，最適溫度的大小是這2種作用相平衡的結果。本試驗中考慮最適溫度為40℃。據文獻報道，雙孢菇[9]、秀珍菇[10]、雞腿蘑[11]、蘑菇[12]、草菇[13]的最適溫度分別為20，35，45，50，35℃。因此可以看出，PPO的最適溫度與原料的來源及底物的種類有關。

2.4 緩沖液pH值對PPO活性測定的影響

緩沖液pH值對PPO活性測定的影響見圖4。

圖4 緩沖液pH值對PPO活性測定的影響

由圖4可知，緩沖溶液pH值在6.7～7.1時對香菇中多酚氧化酶活性影響不大，最適值在pH值為6.9處，與文獻中給定的pH值6.88相差不大。

2.5 三氯乙酸質量分數對PPO活性測定的影響

三氯乙酸質量分數對PPO活性測定的影響見圖5。

圖5 三氯乙酸質量分數對PPO活性測定的影響

由圖5可知，三氯乙酸質量分數為15%（W/V）時，顯示為酶活測定值最好，但是當三氯乙酸質量分數為15%時，反應液顏色呈深褐色，隨著時間增加，顏色逐漸變深為黑褐色，原因可能是此時三氯乙酸質量分數較低，并未使酶失活，反應液顏色較深，所測數值較大，因此該數值為錯誤數值。當三氯乙酸質量分數大于20%后，酶活性測定的數值逐漸減小，造成這樣的結果可能是由于三氯乙酸達到一定的質量分數后，部分過量的三氯乙酸和溶液中的某些物質結合，結合后的物質干擾PPO氧化底物的生成物對紫外光的吸收，而隨著三氯乙酸質量分數的增加，這種干擾物質的量也同步增加，所以造成讀數偏小、酶活降低[14]。因此，在多酚氧化酶活性測定時應選擇適宜的三氯乙酸質量分數。在試驗中，選擇三氯乙酸質量分數為20%（W/V）。

對于類方形蜂窩夾芯，有：θ=0°，h=2l，于是可得設等效單元在yoz面內的剪切模量為Gcyz，則等效單元的總變形能為：

2.6 酶液體積對PPO活性測定的影響

酶液體積對PPO活性測定的影響見圖6。

圖6 酶液體積對PPO活性測定的影響

由圖6可知，當加入的酶液體積為1 mL時，測定的酶活性數值最好。過低的酶液體積使底物生成物生成量少，酶蛋白在低濃度下易失活，可能是亞基易解離、易吸附在容器上和易發生表面變性的原因，測定值不準確；酶液體積過高時測定的酶活值偏小，原因為酶液體積過高，反應速率加快，時間過短，在計算時誤差較大。因此，酶液應選擇合適的液體積，使吸光度在0.1～0.7時較好。試驗選取酶液體積為1 mL。

2.7 底物濃度對PPO活性測定的影響

底物濃度對PPO活性測定的影響見圖7。

圖7 底物濃度對PPO活性測定的影響

由圖7可知，酶活性隨著底物濃度的增加，離心后所測得的酶活性逐漸增加，當底物濃度為0.3 mol/L時達到最大，但在0.4 mol/L時出現負值。

以鄰苯二酚為底物時Lineweaver-Burk曲線見圖8。

圖8 以鄰苯二酚為底物時Lineweaver-Burk曲線

由圖8可知，Vmax=1/1.049 7=0.952 7 min/A410，Km=1/0.513 73=1.946 5 mol/L。擬合直線 Y=0.513 7X+1.049 7，相關系數R2=0.995 1，表明香菇中PPO對鄰苯二酚有很好的親和力。酶催化反應的初始階段與鄰苯二酚底物濃度成正比。結合圖7可得，選取底物濃度為0.3 mol/L的用量較為適宜。

2.8 改進方法的穩定性與再現性

2.8.1 改進方法的穩定性

重復試驗為同一實驗室、同一操作人員條件下按照改進方法，連續3 d測試香菇中多酚氧化酶活性。

香菇PPO活性連續3 d測定值的精密度見表1。

表1 香菇PPO活性連續3 d測定值的精密度

由表1可知，在重復性條件下連續3 d測定的香菇中PPO活性比較穩定，標準差（SD）為0.72，相對標準偏差（RSD）為1.19%。通常相對標準偏差小于5%，說明檢測結果精密度高。結果表明改進的方法在重復條件下，重復性與穩定性均較好。

2.8.2 改進方法的再現性

再現試驗為不同實驗室、另一位操作人員按照改進方法，連續3 d測試香菇中多酚氧化酶活性。

再現條件下香菇PPO活性連續3 d測定值的精密度見表2。

表2 再現條件下香菇PPO活性連續3 d測定值的精密度

由表2可知，在再現性條件下連續3 d測定的香菇中PPO活性也比較穩定，標準差SD為0.82，相對標準偏差RSD為1.33%。結果表明，改進的方法在再現性條件下，重復性與穩定性均較好。試驗結果與劉雅嘉等人[15-16]的研究結果相似，數值大小相近。

綜上所述，試驗改進的香菇中多酚氧化酶活性測定方法在重復性條件及再現性條件下測定的結果相對標準偏差均不超過5%，可見此方法可信，檢測結果可靠。

2.9 改進方法在其他果蔬中的應用

選取香蕉、馬鈴薯、金針菇進行穩定性試驗，在同一實驗室、同一操作人員條件下按照改進方法，連續3 d測試香菇中多酚氧化酶活性。

再現條件下多種果蔬PPO活性連續3 d測定值的精密度見表3。

試驗結果表明，利用改進方法測定香蕉中多酚氧化酶活性時，測定結果與曲留柱[17]的研究結果相近，該研究中使用的測定方法為參考文獻[1]中的方法，測得的香蕉多酚氧化酶活性為80 U/(g·min)左右。但與Wuyts N等人[18]的研究成果相差較大，其原因可能是在提取多酚氧化酶時使用了Triton X-100促使質體膜溶解，激活了潛在的PPO活性。Triton X-100能否應用在香菇的多酚氧化酶活性測定中，還有待進一步研究。利用改進方法測定馬鈴薯多酚氧化酶活性時，測定結果與鞏慧玲等人[19-20]使用參考文獻[1]方法測定的結果相近，測得的馬鈴薯多酚氧化酶活性均在100 U/(g·min)左右。利用改進方法測定金針菇中多酚氧化酶活性的結果與孫月娥等人[21-22]使用參考文獻[1]方法測定的結果相近，測得的金針菇多酚氧化酶活性均在80 U/(g·min)左右，效果較好。由此可見，改進方法在測定多酚氧化酶活性時，獲得的結果與相關文獻中測得的結果相近或優于其他，但操作上更加簡便、準確、完善。

表3 再現條件下多種果蔬PPO活性連續3 d測定值的精密度

在測定改進方法于其他果蔬中的應用時發現，在測定香蕉多酚氧化酶活性時幾乎沒有沉淀生成，在測定馬鈴薯多酚氧化酶活性時有少量沉淀生成，而在測定金針菇時有大量沉淀生成，可能是由于蘑菇類真菌中蛋白質含量較高，遇到三氯乙酸后產生沉淀。

綜上所述，改進方法可以應用于各種水果、蔬菜及蘑菇類的多酚氧化酶活性測定，對于反應過程中容易出現沉淀的多酚氧化酶測定，如蘑菇類等含蛋白較高的產品，該法尤其適用。

3 結論

在文獻中測定PPO活性方法的基礎上，有必要確定反應開始時的測定值，以便確定測定數值的完整性與準確性；反應結束后需進行離心，以消除雜蛋白及其他不溶性物質對試驗結果造成的影響；適宜的溫度、三氯乙酸質量分數、酶液體積與底物濃度對保證酶促反應的順利進行，讓酶活力真實體現也必不可少。

試驗證明，采用分光光度法測定香菇中多酚氧化酶的最佳條件為反應液預熱溫度40℃，添加質量分數20%（W/V）的三氯乙酸，取酶液1 mL，添加濃度0.3 mol/L的鄰苯二酚，反應3 min后進行離心，于波長410 nm處測定吸光度。穩定性與再現性試驗表明，此方法的重復試驗和再現試驗的相對標準偏差性均小于5%，穩定性與再現性均較好。

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Improvement of the Determination of Polyphenol Oxidase Activity in Mushroom（Lentinus edodes（Berk.）sing）

HUANG Heyan，*HAN Chunran，LI Yu，DAI Chuanrong，LIN Congyu，ZHANG Jiacheng （Food and Engineering College，Harbin University of Commerce，Harbin，Heilongjiang 150076，China）

Common methods from literatures for the determination of polyphenol oxidase（PPO） activity in mushroom （Lentinus edodes（Berk）.sing） is improved.Adverse effect of precipitate is removed by centrifugation，at the same time，some factors are also studied，repetition and repeatability tests are conducted.The results show that the optimal conditions for the determination of PPO activity is as follows：preheating temperature of the reaction is 40℃，concentration of trichloroacetic acid is 20%（W/V），the crude enzyme is 1 mL，pyrocatechol is 0.3 mol/L after incubation for 3 min，the reaction liquid is centrifuged and measured the absorbance at 410 nm.Stability and repeatability rests show that the relative standard deviation of both tests is within 5%.

mushroom；polyphenol oxidase；spectrophotometry；improvement；centrifugation

TS207.3

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.11.010

1671-9646（2016）11a-0032-06

2016-09-01

黃赫雁（1990—），女，在讀碩士，研究方向為農產品加工及保鮮。*