HBV+自噬小體疫苗治療HBV急性感染的實驗研究

王璐，薛萌，殷鵬飛，樊飛，曹萌，王立新

(東南大學醫學院 病原生物學與免疫學系，江蘇 南京 210009)

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·論 著·

HBV+自噬小體疫苗治療HBV急性感染的實驗研究

王璐，薛萌，殷鵬飛，樊飛，曹萌，王立新

(東南大學醫學院 病原生物學與免疫學系，江蘇 南京 210009)

目的:探討轉染HBV基因組的HepG2.2.15細胞自噬小體(HBV+DRibbles)誘導HBV特異性免疫應答及其對HBV急性感染的治療作用。方法：ELISA法檢測HBV+DRibbles體外再刺激HBsAg特異性效應細胞產生IFN-γ的水平；對HBV急性感染模型小鼠實施HBV+DRibbles、HBV+DRibbles聯合DC免疫，ELISA法檢測HBV抗原及抗原肽刺激免疫小鼠淋巴細胞產生IFN-γ的含量；ELISA法、熒光定量PCR法和酶法分別檢測小鼠血清HBeAg、HBV DNA、ALT和AST的水平；免疫組織化學法檢測小鼠肝組織HBcAg表達及免疫病理損傷。結果：與培養液對照組和HBsAg蛋白刺激組相比，HBV+DRibbles刺激HBsAg特異性效應細胞能夠產生更高水平的IFN-γ(P=0.004)；與未負載抗原的DC細胞對照組和負載HBsAg的DC刺激組相比，DC負載HBV+DRibbles再刺激HBsAg特異性CD4+、CD8+T細胞均能產生更高水平的IFN-γ(P<0.001)。與PBS對照組相比，HBV+DRibbles疫苗組和HBV+DRibbles聯合DC免疫組均能誘導HBV急性感染模型小鼠產生HBV特異性免疫應答，明顯降低血清HBeAg、HBV DNA水平，減低HBcAg+肝細胞比例，而ALT及AST水平未見明顯差異，肝組織結構基本正常；但HBV+DRibbles疫苗組與HBV+DRibbles聯合DC免疫組之間差異無統計學意義。結論：HBV+DRibbles作為HBV抗原載體，能夠有效誘導DC對HBV抗原的交叉遞呈；HBV+DRibbles誘導的HBV特異性細胞免疫應答對HBV急性感染具有一定的治療作用。

乙型肝炎；乙型肝炎病毒；自噬小體；治療性疫苗；小鼠

乙型肝炎病毒(HBV)感染危及全球人類健康，面對2.4億HBV慢性感染患者，目前尚無理想的治療性疫苗[1-2]。我們前期研究[3-5]顯示,腫瘤細胞來源自噬小體(DRibbles)是腫瘤抗原的有效載體，能刺激樹狀突細胞(DC)活化，交叉遞呈腫瘤抗原，誘導具有治療效果的抗腫瘤免疫應答；而轉染HBV基因組的HepG2.2.15細胞自噬小體(HBV+DRibbles)中富含HBV抗原成分。本研究旨在進一步探討HBV+DRibbles能否有效誘導DC交叉遞呈HBV抗原，從而誘導HBV特異性細胞應答及其對HBV急性感染的治療作用，以期為臨床HBV感染治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級C57BL/6小鼠，雌性，6～8周齡，購自揚州大學實驗動物中心。HepG2.2.15細胞為轉HBV全基因組人肝癌細胞,由本院張建瓊教授惠贈，pAAV/HBV1.2質粒(1.2倍HBV基因組重組腺相關病毒載體質粒)由臺灣大學陳培哲教授惠贈，Flt3-L質粒、GM-CSF質粒由美國波特蘭醫學中心胡紅明教授惠贈，硼替佐米(bortizomib)由中大醫院血液科丁家華主任惠贈,HBsAg純蛋白由南京市第二醫院周振先主任惠贈。雷帕霉素(rapamycin)購自廣州寶柏生物公司，NH4Cl購自南京創瑞生物公司，HBsAg重組疫苗購自江蘇省疾病控制中心，Dynabeads磁珠購自Dynal Biotech公司，HBcAg購自ProSpec公司，HBV肽由上海耀強生物有限公司合成，HBV DNA定量檢測試劑盒及HBV ELISA檢測試劑盒購自上海科華生物工程股份有限公司，RPMI-1640、DMEM培養基購自Invitrogen公司，胎牛血清(FCS)購自Hyclone公司，Bradford蛋白定量試劑盒購自碧云天公司，小鼠IFN-γ檢測試劑盒購自eBioscience有限公司，兔抗人HBc-IgG抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗兔多聚體、聯苯二胺購自中山金橋生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HepG2.2.15細胞用含100 ml·L-1FCS、100 U·ml-1青霉素和鏈霉素的DMEM培養基，置37 ℃、體積分數為5% CO2培養箱培養，2～3 d傳代1次。

1.2.2 HBV+DRibbles制備 取對數生長期HepG2.2.15細胞，加入硼替佐米、雷帕霉素、NH4Cl共孵育16～24 h，胰酶消化，取細胞及培養上清，以1 200 r·min-1離心10 min；取上清，4 ℃以12 000 r·min-1離心30 min；取沉淀，PBS重懸，分裝，-20 ℃凍存備用[3-5]。

1.2.3 HBV+DRibbles蛋白定量 按Bradford蛋白定量試劑盒說明書操作。

1.2.4 HBV+DRibbles中HBsAg定量 RIPA細胞裂解液裂解HBV+DRibbles，置冰上5～10 s，加等量PBS混勻，以10 000 r·min-1離心4 min，取上清。按“乙型肝炎表面抗原診斷試劑盒”說明書檢測HBsAg，繪制標準曲線，計算樣品蛋白含量。

1.2.5 小鼠血清HBV抗原及anti-HBs抗體檢測 按“乙型肝炎表面抗原及表面抗體診斷試劑盒”說明書檢測。

1.2.6 DC細胞的體內誘導 對小鼠于第1天尾靜脈高壓注射法注射Flt3-L質粒，5 μg·只-1；于第10天相同方法及劑量注射GM-CSF質粒；第15天收獲小鼠脾細胞，以1 200 r·min-1離心10 min，取沉淀紅細胞裂解液裂解5 min；加PBS以1 200 r·min-1離心10 min；無血清RPMI-1640培養液重懸，調整細胞至2×107ml-1，-196 ℃液氮凍存。

1.2.7 DC細胞交叉遞呈HBV抗原 重組HBsAg疫苗免疫小鼠：左下肢外側肌肉注射2 μg·只-1，隔天加強，共2次。免疫14 d后采血，分離血清，檢測HBsAb。取抗體陽性小鼠脾臟及淋巴結來源的淋巴細胞作為HBsAg特異性細胞，加入48孔細胞培養板，終濃度2×106ml-1，分別用梯度稀釋的HBV+DRibbles、HBsAg蛋白(HBsAg:100、30、0 ng·ml-1；DRibbles:30、3、0 ng·ml-1，DRibbles劑量為其所含HBsAg量)再刺激，ELISA法檢測培養72 h后上清中IFN-γ含量。進一步磁珠分選CD4+和CD8+T細胞，加入48孔細胞培養板，終細胞濃度2×106ml-1；復蘇DC細胞，加入1 μg·ml-1LPS，同時分別加入30 ng HBsAg蛋白及含30 ng HBsAg的HBV+DRibbles，37 ℃共孵育6 h，取出;加PBS洗滌，以1 200 r·min-1離心10 min，共3次;將DC加入分選細胞板孔中，終細胞濃度1×106ml-1，ELISA法檢測培養72 h上清中IFN-γ的含量。

1.2.8 HBV+DRibbles單獨或聯合DC免疫誘導HBV特異性細胞應答 小鼠尾靜脈高壓注射pAAV/HBV1.2質粒[6]，第3天按血清HBeAg水平配對分組，設PBS對照組、HBV+DRibbles疫苗組及HBV+DRibbles聯合DC(DRibbles+DC)免疫組。HBV+DRibbles疫苗組：于質粒注射后第3天，HBV+DRibbles疫苗初次腹股溝淋巴結免疫，每只30 μg·(20 μl)-1，第5、7天分別皮下加強，每只30 μg·(200 μl)-1。DRibbles+DC免疫組：HBV+DRibbles腹股溝淋巴結初次免疫，每只30 μg·(20 μl)-1，第5、7天分別腹部皮下注射負載HBV+DRibbles的DC加強免疫，2×106只-1。于免疫后第8天處死小鼠，取脾臟與淋巴結來源的淋巴細胞，加入48孔板，終細胞濃度2×106ml-1；分別加入10 μg·ml-1HBsAg、HBcAg、HBc129-140(PPAYRPPNAPIL)、HBs190-197(VWLSVIWM)，于37 ℃、體積分數5% CO2下培養72 h，ELISA法檢測上清中IFN-γ水平。

1.2.9 負載HBV+DRibbles的DC制備 復蘇DC，調整為2×106只-1，加HBV+DRibbles 30 μg·只-1，LPS 1 μg·ml-1，培養6 h；取出，加PBS洗滌，以1 200 r·min-1離心10 min，共3次；PBS重懸DC，置冰上備用。

1.2.10 HBV+DRibbles單獨或聯合DC治療HBV急性感染 分組與免疫同方法1.2.8；于末次免疫后第14天采血，分別采用ELISA法、熒光定量PCR法、酶法檢測小鼠血清HBeAg、HBV DNA、ALT及AST水平[7]；處死小鼠，取肝組織，免疫組織化學法檢測肝細胞內HBcAg表達，顯微鏡計數HBcAg+肝細胞比例，HE染色觀察肝組織病理變化。

1.2.11 HBV DNA檢測 按“乙肝病毒核酸定量試劑盒PCR熒光探針法”說明書操作。

1.2.12 HE染色及免疫組織化學染色檢測 100 ml·L-1甲醛固定肝組織，石蠟包埋；切片脫蠟。HE染色：至水，蘇木素染色，分化，伊紅復染，干燥封片。免疫組織化學染色：抗原修復；PBST(5 ml·L-1吐溫20 PBS)洗滌，加兔抗人HBcAg-IgG(1∶150)，4 ℃過夜；PBST洗滌，加HRP標記羊抗兔多聚體，37 ℃ 30 min；PBST洗滌，加DAB顯色；流水沖洗，蘇木素復染；分化；干燥，脫水；透明；封片。

1.2.13 轉氨酶檢測 貝克曼庫爾特LX20全自動生化儀酶法檢測。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 HBV+DRibbles刺激HBsAg特異性效應細胞的體外增殖

HBV+DRibbles、HBsAg體外再刺激HBsAg免疫小鼠淋巴細胞，ELISA法檢測培養上清IFN-γ顯示,與培養液對照組及HBsAg蛋白刺激組相比，HBV+DRibbles刺激組能夠產生更高水平IFN-γ，差異具有統計學意義(P<0.05)(圖1A)。分選獲得HBsAg免疫小鼠的CD4+或CD8+T細胞，加入負載HBV+DRibbles或HBsAg的DC細胞體外再刺激結果顯示，與未負載抗原對照組和負載HBsAg的DC組相比，負載HBV+DRibbles的DC組均能夠再刺激CD4+或CD8+T細胞產生更高水平IFN-γ，差異具有統計學意義(P<0.001)(圖1B、C)。提示：HBV+DRibbles是交叉遞呈HBV抗原的有效載體。

A.HBV+DRibbles、HBsAg體外刺激HBsAg特異性效應細胞72h，ELISA法檢測培養上清IFN-γ含量(n=3);B、C.HBV+DRibbles、HBsAg負載DC細胞體外刺激HBsAg特異性CD4+、CD8+T細胞72h，ELISA法檢測培養上清IFN-γ含量(n=3)

圖1 HBV+DRibbles刺激HBsAg特異性效應細胞體外增殖

A.HBsAg-specific effector cells were re-stimulated with HBV+DRibbles or soluble HBsAg for 72 h,the levels of IFN-γ in supernatants were measured by ELISA(n=3); B，C.Immunomagnetic beads sorted CD4+or CD8+T cells were co-cultured with HBV+DRibbles or HBsAg preloaded DC for 72 h,the levels of IFN-γ in supernatants were determined by ELISA(n=3)

Fig 1 The proliferation of HBsAg-specific effector cells re-stimulated with HBV+DRibblesinvitro

2.2 HBV+DRibbles疫苗單獨或聯合DC免疫誘導HBV特異性細胞應答

分別采用HBV+DRibbles及DRibbles+DC疫苗免疫小鼠，收獲小鼠脾細胞，加入HBsAg、HBs肽、HBcAg和HBc肽體外再刺激，ELISA法檢測培養上清IFN-γ含量。與PBS對照組相比，HBV抗原及肽再刺激HBV+DRibbles疫苗免疫小鼠的淋巴細胞，均能夠產生較高水平IFN-γ，差異具有統計學意義(P<0.05)。與HBV+DRibbles疫苗組相比，DRibbles+DC免疫組IFN-γ水平有一定程度升高，但差異無統計學意義(P>0.05)(圖2)。提示：HBV+DRibbles疫苗單獨或聯合DC免疫均能夠誘導多種HBV抗原及肽特異性的免疫應答。

2.3 HBV+DRibbles疫苗單獨或聯合DC免疫對HBV急性感染的治療作用

以pAAV/HBV1.2質粒[6]尾靜脈高壓注射C57BL/6小鼠誘導的HBV感染初期模擬急性HBV感染階段，對HBV急性感染模型小鼠實施HBV+DRibbles單獨或聯合DC治療性免疫。與PBS對照組相比，HBV+DRibbles單獨或聯合DC免疫均能有效降低小鼠血清HBeAg水平(圖3A)、HBV DNA水平(圖3B)、肝細胞內HBcAg表達水平及HBcAg+肝細胞比例(圖3C、D)，差異具有統計學意義(P<0.05)；同時，與HBV+DRibbles疫苗組相比，DRibbles+DC免疫組小鼠血清HBeAg(圖3A)、HBV DNA水平(圖3B)、肝細胞內HBcAg表達及HBcAg+肝細胞比例(圖3C、D)的差異均無統計學意義(P>0.05)。提示：HBV+DRibbles疫苗單獨或聯合DC細胞免疫對HBV急性感染具有一定的治療作用。

圖2 HBV感染急性期不同方案免疫誘導HBV特異性細胞應答(n=3)

Fig 2 Cellular response induced in acute HBV infection(n=3)

為了觀察疫苗治療是否會造成小鼠肝組織損傷，我們檢測了小鼠血清轉氨酶水平及肝組織病理變化。與未免疫PBS對照組相比，HBV+DRibbles單獨及聯合DC免疫組小鼠血清ALT、AST水平未見明顯變化(圖4A、B)，肝組織結構基本正常，僅見輕度小灶性壞死伴少量炎癥細胞浸潤(圖4C)。提示：HBV+DRibbles單獨或聯合DC細胞疫苗治療未造成明顯的免疫病理損傷。

A、B.ELISA法及熒光定量PCR法檢測血清HBeAg及HBV DNA水平; C.顯微鏡計數HBcAg+肝細胞數量; D.免疫組織化學法觀察小鼠肝細胞內HBcAg表達(n=6 ×200)

圖3 HBV+DRibbles疫苗對HBV急性感染治療效果的檢測

A，B.The levels of serum HBeAg and HBV DNA was determined by ELISA and real-time PCR.C.The percentage of HBcAg+hepatocytes was counted under microscope.D.Intrahepatic HBcAg was visualized by immunohistochemical staining(n=6 ×200)

Fig 3 Therapeutic efficacy of HBV+DRibbles vaccine in acute HBV infection

3 討 論

HBV感染的控制和病毒的清除有賴于機體免疫系統，慢性HBV感染的機體產生HBV特異性免疫應答能力受損。HBV主要感染肝細胞，而肝細胞缺乏共刺激分子，直接遞呈HBV抗原途徑不能有效誘導CD8+T細胞活化，專職抗原遞呈細胞的交叉遞呈被普遍認為是誘導HBV特異性CD8+T細胞應答的重要途徑[8-10]。本研究證實,HBV+DRibbles作為HBV抗原的有效載體，不僅能夠誘導DC對HBV抗原的直接遞呈，而且能夠誘導DC對HBV抗原的交叉遞呈，從而誘導有效的CD8+T細胞應答。

本研究中，HBV+DRibbles疫苗通過淋巴結注射途徑免疫小鼠。與其他免疫途徑相比，淋巴結組織富含DC等抗原遞呈細胞，抗原直接注射能夠靶向這些細胞，延長其接觸抗原的時間，增強對抗原的攝取，使得更多DC接觸T細胞，從而刺激大量T細胞活化，誘導產生高水平、特異性CTL應答[11-14]。我們前期抗腫瘤研究顯示,將DRibbles疫苗直接注射腹股溝淋巴結，可以募集大量DC并促進T細胞活化與增殖，進一步促進DC對抗原的交叉遞呈，引發強烈、特異性的CTL應答。本研究顯示，在模擬HBV急性感染的模型小鼠中，采用HBV+DRibbles疫苗初次淋巴結免疫伴皮下加強的免疫策略，能夠誘導產生HBV多特異性細胞免疫應答，有效抑制HBV復制、清除HBV感染的肝細胞。

為了進一步增強疫苗的免疫效果，我們在疫苗組分中增加DC。通過小鼠尾靜脈高壓注射法，聯合輸注FMS樣酪氨酸激酶3配體(Flt3L)質粒和GM-CSF質粒，收獲小鼠脾臟，制備DC[15]。通過流式細胞儀檢測證實，小鼠聯合輸注Flt3L質粒和GM-CSF質粒后，脾臟細胞中CD11c+細胞比例達10%～30%，且DC具有多種亞群。

研究顯示，與HBV+DRibbles疫苗單獨免疫組相比，DRibbles+DC免疫組誘導的細胞應答水平有增強趨勢，但細胞應答水平與治療效果均無差異，分析可能與實驗中所制備的DC有關。近來研究發現，采用Flt3L擴增人DC的同時也會導致CD4+FoxP3+Treg細胞增殖，降低人外周血中CD8+T細胞與Treg細胞比例[16]。GM-CSF來源的DC能夠誘導T細胞無能及轉換初始T細胞為FoxP3+Treg細胞[17]；且我們在收獲脾細胞時未能進一步純化DC，其中CD11c+細胞只占10%～30%，含有非DC組分，而這些非DC組分亦可能發揮了免疫抑制作用；另外，疫苗的施用劑量、途徑等亦可能影響治療效果[18]。本研究為慢性HBV感染的治療提供了新思路。

A、B.全自動生化儀酶法檢測小鼠血清ALT、AST水平；C.HE染色觀察肝組織結構(n=6 ×400)

圖4 HBV+DRibbles疫苗治療的免疫病理損傷觀察

A，B.Serum ALT and AST levels were measured on automated clinical chemistry analyzer.C.The liver sections were stained with hematoxylin-Eosin(n=6 ×400)

Fig 4 Liver immunopathology mediated by HBV+DRibbles vaccination

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Study on therapeutic efficacy of autophagosome derived from HepG2.2.15 cells against acute HBV infection

WANG Lu,XUE Meng,YIN Peng-fei,FAN Fei,CAO Meng,WANG Li-xin

(DepartmentofMicrobiologyandImmunology,SchoolofMedicine,SoutheastUniversity,Nanjing210009,China)

Objective： To investigate the ability of HBV antigens inducing DC cross-presentation and to elicit HBV specific immune response by HepG2.2.15 cells(HBV+DRibbles)invitroand its effectiveness in acute HBV-infected mouse model.Methods: HBsAg-specific effector cells were re-stimulated with HBV+DRibbles or soluble HBsAg, then isolated CD4+or CD8+T cells were co-cultured with HBV+DRibbles or HBsAg preloaded DC.The levels of IFN-γ in supernatants were measured by ELISA.Lymphocytes from HBV+DRibbles alone or in combination with DC immunized acute HBV-infected mice or unvaccinated control mice were re-stimulated with HBV antigens and peptides, and the amounts of IFN-γ in supernatant were analyzed by ELISA.The levels of serum HBeAg, HBV DNA, ALT and AST were detected by ELISA, real-time PCR and enzyme method, respectively.The expression of HBcAg in hepatocytes was determined by immunohistochemical staining and the percentage of HBcAg+hepatocytes was counted under microscope.The liver sections were stained with hematoxylin-eosin.Results: The HBV+DRibbles stimulated HBsAg specific lymphocytes produced much higher IFN-γ than soluble HBsAg(P=0.004).Also, the CD4+or CD8+T cells re-stimulated by HBV+DRibbles preloaded dendritic cells generated significant higher IFN-γ(P<0.001).Levels of IFN-γ in supernatants of HBV antigens and peptides re-stimulated lymphocytes from the mice immunized with HBV+DRibbles alone or combined with DC were much higher than that of control group.While the differences were not significant between the mice vaccinated with HBV+DRibbles alone and in combination with DC.Compared with unvaccinated control group, both of the therapies could remarkably reduce the levels of HBeAg and HBV DNA and decrease HBcAg expression in hepatocytes and the percentage of HBcAg+hepatocytes, whereas the serum ALT and AST levels were not affected by vaccinations.The livers showed normal architecture and a mild inflammatory responses.No significant difference was observed between the mice treated with HBV+DRibbles alone and in combinationinvivo.Conclusion: HBV+DRibbles are efficient antigen carriers for effective cross-presentation.HBV+DRibbles can induce multiple HBV-specific T cell responses, effectively suppress HBV replication, clear the HBV-infected hepatocytes and do not cause severe liver damage.HBV+DRibbles in combination with DC do not further improve the therapeutic efficacy．

hepatitis B; hepatitis B rirus; autophagosome; therapeutic vaccine; mice

2016-02-25

2016-04-25

國家自然科學基金資助項目(31370895,31170857,30972783)

王璐(1983-)，女，安徽合肥人，主管檢驗師，醫學碩士。E-mail:joy83627@126.com

王立新 E-mail:lxwang@seu.edu.cn

王璐，薛萌，殷鵬飛，等.HBV+自噬小體疫苗治療HBV急性感染的實驗研究[J].東南大學學報：醫學版，2016，35(5)：647-653.

R392.11; R512.62

A

1671-6264(2016)05-0647-07

10.3969/j.issn.1671-6264.2016.05．001