吡那地爾對術后持續性疼痛大鼠脊髓JNK/MCP-1釋放的影響

朱翔，曹蘇，秦毅彬，佘慶，丁晶晶，楊建平

(1.蘇州大學附屬第一醫院 麻醉科，江蘇 蘇州 215006；2.南通大學附屬醫院 麻醉科，江蘇 南通 226001)

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·論 著·

吡那地爾對術后持續性疼痛大鼠脊髓JNK/MCP-1釋放的影響

朱翔1，曹蘇2，秦毅彬2，佘慶2，丁晶晶2，楊建平1

(1.蘇州大學附屬第一醫院 麻醉科，江蘇 蘇州 215006；2.南通大學附屬醫院 麻醉科，江蘇 南通 226001)

目的：觀察吡那地爾(pinacidil)對術后持續性疼痛大鼠脊髓JNK/MCP-1釋放的影響。方法:隨機將35只大鼠分為正常組(Control組)、假手術組(Sham組)、切割+牽拉皮膚肌肉組(SMIR組)、溶劑+SMIR組(Vehicle組)、吡那地爾+SMIR(Pina組)、吡那地爾+格列苯脲+SMIR組(Pina+Gli組)、格列苯脲+SMIR組(Gli組)等7組。檢測各組機械刺激縮足反射痛閾值(MWT)，Western blot/ELISA法檢測脊髓JNK/MCP-1蛋白表達。結果：(1) 與Sham組相比，SMIR組MWT在術后3 d開始降低(P<0.01)，并持續21 d(P<0.001)以上；(2) SMIR術后持續顯著上調脊髓JNK/MCP-1的表達(P<0.01)；(3) 鞘內注射吡那地爾顯著下調術后SMIR誘導的脊髓JNK/MCP-1表達(P<0.01)和上調MWT(P<0.01)，格列苯脲能阻斷吡那地爾所引起的上述變化(P<0.05)。結論：吡那地爾能抑制切割及牽拉皮膚肌肉所致的術后持續性疼痛，其機制可能與抑制JNK/MCP-1的上調有關。

術后持續性疼痛；吡那地爾；JNK/MCP-1；脊髓；大鼠

臨床上10%～50%的患者隨著術后炎癥的消退或者組織痊愈，存在術后慢性持續性疼痛[1]，因此術后急性痛轉為慢性痛機制的研究成為重要課題之一。ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive potassium,KATP)廣泛分布在中樞神經系統，調節細胞膜興奮性和神經遞質的釋放，對神經系統起到保護作用，激活KATP可介導鎮痛作用[2-3]。c-Jun氨基末端激酶(JNK)在脊髓星狀膠質細胞持續激活可產生中樞敏化，JNK/MCP-1的活化是神經病理性痛形成的關鍵，抑制其活化可減輕痛覺過敏[4]。本研究觀察KATP開放劑吡那地爾對術后持續性疼痛大鼠脊髓JNK/MCP-1變化的影響，探討激活KATP產生鎮痛的作用及其可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本研究經南通大學實驗動物保護和使用倫理委員會批準。SPF級SD雄性大鼠35只南通大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(蘇)2008-0010，鼠齡7～9周，質量200～250 g。

1.2 主要儀器、藥品、材料

0.25%二甲基亞砜、多聚甲醛、吡那地爾、格列苯脲(美國Sigma公司)，胰蛋白酶(中國華美生物工程公司)，異氟烷(英國RHODIA公司)，von Frey纖毛刺激儀(美國North Coast Medical公司)，電泳及轉膜系統(美國Bio-Rad Laboratories公司)，熒光實時定量PCR儀器(美國Eppendorf公司)，凝膠成像系統(中國北京原平皓生物技術有限公司)，動物麻醉機(美國A.M.BICKFORD INC公司)，ELX8W酶聯免疫檢測儀(美國BioTek公司)，電動勻漿器(美國Biospec Products INC公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及處理 隨機將大鼠分7組，即正常組(Control組)、假手術組(Sham組)、切割+牽拉皮膚肌肉組(SMIR組)、溶劑+SMIR組(Vehicle組)、吡那地爾+SMIR(Pina組)、吡那地爾+格列苯脲+SMIR組(Pina+Gli組)、格列苯脲+SMIR組(Gli組)，每組5只。正常組不做任何處理；Sham組僅切割皮膚、肌肉1 h；SMIR組切割+牽拉皮膚、肌肉1 h；Vehicle組在SMIR術后7 d鞘內注射等體積0.25%二甲基亞砜；Pina組在SMIR術后7 d鞘內注射4 μg·kg-1或20 μg·kg-1吡那地爾；Pina+Gli組在SMIR術后7 d鞘內注射20 μg·kg-1吡那地爾+20 μg·kg-1格列苯脲；Gli組在SMIR術后7 d鞘內注射20 μg·kg-1格列苯脲。各組動物常規飼養。

1.3.2 大鼠SMIR模型的建立 按Flatters法[5]建立大鼠SMIR模型。麻醉后仰臥大鼠，在大腿中部隱靜脈內側3～4 mm處做2 cm切口，暴露肌肉，然后在淺層肌肉(股薄肌)處做一長約8 mm切口，鈍性分離肌肉，撐開器拉開至2 cm，1 h后縫合皮膚肌肉，見圖1。

圖1 大鼠SMIR模型手術示意圖

1.3.3 行為學檢測 測定各組術前及術后機械刺激縮足反射痛閾值(MWT)，測試之前各組大鼠適應環境3 d。測試時大鼠放置有機玻璃的金屬篩網上適應30 mim，剛度呈對數遞増(1.4～26 g)的von Frey纖毛刺激儀垂直刺激術側后肢爪底，持續時間≤4 s,出現縮爪、甩爪、舔爪等現象視為陽性反應，否則為陰性，記錄5次結果，有2次或2次以上反應則為機械性觸誘發痛。若出現小于2次陽性反應，則使用高一級別力度刺激，若2次或以上陽性反應則給予低一級別力度刺激。連續實施刺激，直到出現1次陽性和陰性反應騎跨，記錄數值，然后再測量5次，每次間隔30 s。

1.3.4 脊髓鞘內注射藥物 應用異氟烷吸入麻醉，備皮消毒，在第3、4或第4、5腰椎棘突間使用29gauge(B-D公司)注射針，注射20 μl的藥物到大鼠蛛網膜下隙，穿刺是否成功主要觀察大鼠在穿刺時尾巴突然出現顫動或向側方甩動。

1.3.5 ELISA法 術后第10天鞘內注藥并測定機械痛閾后，腹腔注射4%水合氯醛(400 mg·kg-1)深麻醉大鼠，取左側L 3～5脊髓節段，加入裂解液，冰上充分勻漿，離心后收集上清液。按照每孔200 mg的量與ddH2O配成100 μl總體積，稀釋10倍后按照試劑盒說明書操作，檢測各組脊髓組織中MCP-1的含量。根據標準曲線計算實際質量濃度，以ng·L-1表示。

1.3.6 Western blot 腹腔注射10%水合氯醛400～500 mg·kg-1麻醉，取脊髓腰膨大L 3～5節段組織，加入蛋白裂解液勻漿，收集細胞裂解液0.2 ml，離心提取總蛋白，蛋白變性，4 ℃保存。每孔上樣量含30 μg總蛋白行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，電泳后轉膜于0.2 μm PVDF膜，以含5%脫脂奶粉的TBST封閉液室溫封閉2 h。4 ℃過夜，加入以封閉液稀釋的JNK(蘇氨酸183/酪氨酸185)(兔，1∶1 000稀釋，CST，9251)一抗，4 ℃孵育過夜。用TBST洗10 min 3次，用相應二抗(Bioworld，1∶2 000)室溫孵育2 h，漂洗后應用化學發光底物試劑盒在凝膠成像系統中進行檢測。使用Image J圖像軟件對結果進行分析，GAPDH為內參照，各組目的蛋白與各組內參蛋白灰度值的比值表示各組目的蛋白的相對表達量。

1.4 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行統計分析，所有計量資料以均數±標準誤表示，組間的比較采取單因素方差分析(One way ANOVA)，兩兩間的比較采用t檢驗(Student’sttest)，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 SMIR誘導快速機械觸誘發痛

SMIR術后，大鼠手術側后爪的MWT從術后3 d開始下降(P<0.01)，并維持至21 d(P<0.001)。SMIR組的MWT在所有時間點上顯著低于假手術組(P<0.001)。見圖2。

與Sham組比較，aP<0.01; bP<0.001。BL.術前基礎值

圖2 SMIR誘導的大鼠機械痛敏時程的變化

Fig 2 Time course of SMIR-induced mechanical allodynia in rats

2.2 SMIR持續上調脊髓P-JNK和MCP-1的表達

與正常組比較，SMIR組術后3、7、14 d脊髓中P-JNK和MCP-1的表達持續增高(P<0.05、0.01、0.001)。見圖3。

2.3 鞘內注射吡那地爾上調MWT

SMIR術后7 d，鞘內注射吡那地爾呈劑量依賴性顯著拮抗由SMIR誘導MWT下降，作用時間持續2 h以上，但吡那地爾的鎮痛作用可被格列本脲拮抗(P<0.05)，而溶劑組無顯著影響，見圖4。

與Control組比較，aP<0.05; bP<0.01; cP<0.001

圖3 SMIR持續上調脊髓P-JNK/MCP-1的表達

Fig 3 SMIR induced a persistent p-JNK/MCP-1 increase in the spinal cord

與Vehicle組比較，aP<0.05,bP<0.01; 與Pina 20 μg組比較，cP<0.05。BL.術前基礎值

圖4 鞘內注射吡那地爾上調MWT

Fig 4 Intrathecal administration of Pina inhibits mechanical allodynia after SMIR

2.4 鞘內注射吡那地爾下調P-JNK和MCP-1的表達

與Control組相比，Vehicle組P-JNK和MCP-1的表達顯著增加(P<0.01或0.001)，Pina組無顯著差異；與Vehicle組相比，Pina組P-JNK和MCP-1的表達顯著降低(P<0.01)。見圖5。

與Control組比較，aP<0.01,bP<0.01;與Vehicle組比較，cP<0.01

圖5 鞘內注射吡那地爾下調P-JNK/MCP-1的表達

Fig 5 Intrathecal administration of Pina downregulates P-JNK/MCP-1 activation after SMIR

3 討 論

本研究根據文獻建立大鼠SMIR術后持續性疼痛模型，能較長時間牽拉皮膚和肌肉組織而不損傷其周圍外周神經，從而能模擬切口周圍炎性微環境的特點和術后持續性疼痛過程，術后主要表現為持續機械痛覺超敏，術后MWT呈時間依賴性顯著下降(圖2)，表明大鼠術后持續性疼痛模型制備成功。

離子通道在疼痛信號的產生和傳導中起重要作用[6]。近來一些實驗研究發現，K+通道的一個亞族KATP離子通道在疼痛的發生和發展過程中也起著積極和關鍵的作用。KATP通道廣泛分布在中樞神經元系統，其作用主要是調節細胞膜興奮性和神經遞質釋放，同時還起著神經保護作用。它的活化通過調節細胞電活動[7]、增加ATP的合成[8]、減少自由基[9]、防止Ca2+超載和維持線粒體功能[10]等多種機制改善微環境參與預適應保護。超敏疼痛的大鼠KATP開放被抑制[6，11]。但KATP通道的鎮痛作用機制的研究目前還很少。

JNK家族是促分裂原活化蛋白激酶超家族成員之一，JNK的激活可誘導脊髓產生多種炎癥介質的表達和釋放，如一氧化氮合酶、環氧合酶等，JNK的激活也能誘導細胞因子和趨化因子表達和釋放，從而產生中樞敏化[2]。JNK是MAPK信號通路中的關鍵亞族，在疼痛的發生和發展中起著重要的作用。在SNL模型中，磷酸化的JNK(活性形式)已被證明在細胞內信號傳導中起關鍵作用。JNK的活化又可使脊髓MCP-1大量表達，從而活化膠質細胞，MCP-1通過趨化因子受體2(CC chemokinereceptor2，CCR2)的介導參與慢性疼痛的形成和維持[12-13]。在本研究中，SMIR持續上調術后脊髓JNK/MCP-1的表達(圖3)，激活脊髄JNK/MCP-1信號產生中樞敏化，從而參與疼痛。SMIR術后7 d鞘內注射KATP開放劑吡那地尓后，顯著抑制脊髓JNK/MCP-1的表達激活(圖5)，下調機械性觸誘發痛(圖4)，而吡那地爾的阻滯劑格列苯脲能夠阻滯這一鎮痛作用，表明激活KATP通過抑制脊髄JNK/MCP-1信號活性產生鎮痛作用。

本研究表明，KATP通道開放劑是減輕術后疼痛的有效方法。這種影響可能是通過JNK/MCP-1通路的激活介導的，作為KATP通道可能在神經元和膠質細胞不同的功能作用，需要進一步的研究來探討?？傊?，KATP通道可作為術后疼痛治療的有效靶點。

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Effect of pinacidil on JNK/MCP-1 expression in spinal cord of a rat model of persistent postoperative pain

ZHU Xiang1，CAO Su2，QIN Yi-bin2，SHE Qing2，DING Jing-jing2，YANG Jian-ping1

(1.DepartmentofAnesthesiology，theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity，Suzhou215006，China;2.DepartmentofAnesthesiology，AffiliatedHospitalofNantongUniversity，Nantong226001，China)

Objective：To observe the effect of pinacidil on JNK/MCP-1 expression in spinal cord of a rat model of persistent postoperative pain.Methods：SD rats were divided into 7 groups randomly:control group(Control group), sham operation group (Sham group), skin/muscle incision and retraction group (SMIR group), vehicle +SMIR group (Vehicle group), pinacidil+SMIR (Pina group), pinacidil+ glibenclamide +SMIR group (Pina+Gli group) and glibenclamide +SMIR group (Gli group).The mechanical withdrawal threshold (MWT) of the left hind paw of rats in different group was measured at different time points after the surgery.Western blot/ELISA were used to measure the protein expression level of JNK/MCP-1.Results：(1) Compared with Sham group，MWT in SMIR group was reduced significantly from 3 d after the operation (P<0.01)，and lasted for more than 21 d (P<0.001).(2) The protein expression of JNK/MCP-1 were significantly increased after SMIR as compared with the control group(P<0.01).(3) Intrathecal injection of pinacidil attenuated the express of JNK/MCP-1 in the spinal cord (P<0.01) and up-regulated the MWT (P<0.01)，which could be blocked by glibenclamide (P<0.05).Conclusion：Pinacidil inhibits the persistent postoperative pain caused by SMIR.The mechanisms may be partly due to the inhibition of JNK/MCP-1 upregulation．

persistent postoperative pain; pinacidil; JNK/MCP-1; spinal cord; rats

2016-03-29

2016-05-20

國家自然科學基金資助項目(81400915)；南通大學附屬醫院轉化醫學基地科研項目(TDFzh2014013)

朱翔(1978-)，男，江蘇南通人，在讀醫學博士研究生。E-mail:bobofly8850@sina.com

楊建平 E-mail:szyangjp@126.com

朱翔，曹蘇，秦毅彬，等.吡那地爾對術后持續性疼痛大鼠脊髓JNK/MCP-1釋放的影響[J].東南大學學報：醫學版，2016，35(5)：678-682.

R-332; R972.4

A

1671-6264(2016)05-0678-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2016.05．007