新疆維吾爾族宮頸癌患者人乳頭瘤病毒感染與外周血中Th17細(xì)胞水平的相關(guān)性研究

張園，馮陽(yáng)春，黃艷春

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 1.腫瘤防治研究所，2.檢驗(yàn)科，新疆 烏魯木齊 830011)

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·論 著·

新疆維吾爾族宮頸癌患者人乳頭瘤病毒感染與外周血中Th17細(xì)胞水平的相關(guān)性研究

張園1，馮陽(yáng)春2，黃艷春2

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 1.腫瘤防治研究所，2.檢驗(yàn)科，新疆 烏魯木齊 830011)

目的:檢測(cè)新疆維吾爾族宮頸癌患者人乳頭瘤病毒(HPV)感染狀況及外周血中Th17細(xì)胞比例，探討HPV感染與Th17細(xì)胞表達(dá)的關(guān)系。方法:采用二代雜交捕獲法及流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)宮頸癌組(維吾爾族50例)、正常對(duì)照組(維吾爾族50例)的HPV感染狀況和外周血中Th17細(xì)胞比例。結(jié)果:維吾爾族宮頸癌組HPV檢出率96.0%，正常對(duì)照組HPV檢出率為6.0%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同期別的宮頸癌的HPV病毒載量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨宮頸癌的FIGO分期期別越高，HPV病毒載量越高。維吾爾族宮頸癌組患者外周血Th17細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例較正常對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Th17細(xì)胞水平在HPV陽(yáng)性與陰性組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且隨HPV載量的升高，Th17細(xì)胞表達(dá)水平也升高，兩者呈正相關(guān)(r=0.55，P<0.001)；外周血Th17細(xì)胞表達(dá)水平與FIGO分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)均呈正相關(guān)(r值分別為0.75、0.59、0.62，均P<0.001)。結(jié)論:Th17細(xì)胞在HPV持續(xù)感染所致宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用。

宮頸癌；Th17細(xì)胞；人乳頭瘤病毒；維吾爾族

宮頸癌(cervical cancer)是最常見(jiàn)的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，而在新疆地區(qū)維吾爾族宮頸癌發(fā)病率顯著高于該地區(qū)其他民族[1]。超過(guò)90%的宮頸癌患者人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)檢測(cè)均為陽(yáng)性。在HPV病毒持續(xù)感染及其他多種因素的協(xié)同作用下，宮頸鱗狀上皮細(xì)胞的免疫機(jī)制遭到破壞。因此，宮頸癌患者體內(nèi)免疫微環(huán)境的變化在疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起了重要的作用[2]。Th17(T helper 17)細(xì)胞是一種能特異性地產(chǎn)生IL-17(interleukin 17，IL-17)的新型CD4+T細(xì)胞。Th17細(xì)胞在對(duì)抗惡性腫瘤、自身免疫性疾病和移植物抗宿主等疾病中起到保護(hù)性免疫應(yīng)答作用，且IL-17的水平與多種疾病預(yù)后和轉(zhuǎn)歸相關(guān)[3-4]。

本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)研究新疆維吾爾族宮頸癌患者HPV感染狀況及外周血Th17細(xì)胞表達(dá)水平，探討兩者的關(guān)系及其在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用和意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

宮頸癌組：2014年1月至12月于新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦科住院的維吾爾族宮頸癌患者50例，所有患者術(shù)前均未經(jīng)化療、放射或生物治療，均有明確病理分型及臨床分期(FIGO)。術(shù)前無(wú)菌采集外周血3 ml加肝素抗凝；根據(jù)宮頸癌FIGO分期將患者分為Ⅰ期患者11例，Ⅱ期患者14例，Ⅲ期患者15例，Ⅳ期患者10例。

對(duì)照組：選取維吾爾族健康體檢者50例作為對(duì)照，對(duì)照組年齡與宮頸癌組匹配。所有研究對(duì)象均無(wú)自身免疫性疾病史，無(wú)傳染病史以及其他種類惡性腫瘤。

1.2 主要試劑和設(shè)備

采用HC2-HPV-DNA基因雜交信號(hào)放大系統(tǒng)檢測(cè)HPV，儀器及試劑均為美國(guó)Digene公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀FC500，美國(guó)Beckman Coulter公司產(chǎn)品；抗IL-17A-PE/Cy7，美國(guó)BioLegend產(chǎn)品；抗CD4-PC5，美國(guó)Beckman Coulter產(chǎn)品；Leukocyte Activation Cocktail，美國(guó)BD公司產(chǎn)品；固定破膜劑試劑盒，eBioscience公司產(chǎn)品；RPMI-1640培養(yǎng)基，Gibco產(chǎn)品；小牛血清，杭州四季青生物公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 HPV檢測(cè) 使用專用的HPV采樣刷置于宮頸口鱗、柱狀上皮交界處采集標(biāo)本。利用基因雜交、化學(xué)發(fā)光、信號(hào)放大的原理，在分子水平上檢測(cè)被WHO確認(rèn)的13種高危型HPV(HR-HPV)病毒DNA。標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果以光量讀數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性測(cè)定值比值(RLU/PC)報(bào)告，以試劑盒內(nèi)附的參考值為判斷標(biāo)準(zhǔn)，即RLU/PC>1時(shí)，高危型HPV陽(yáng)性，反之則為陰性，RLU/PC數(shù)值越高表示標(biāo)本所含病毒載量越高。將HR-HPV病毒載量分為4組，低載量1～<10；中低載量10～<100；中高載量100～<1 000；高載量≥1 000。

1.3.2 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Th17細(xì)胞水平 在無(wú)菌試管中加入200μl肝素鈉抗凝全血，再加入等量1 640培養(yǎng)基(含小牛血清)混勻，加入2μl白細(xì)胞活化混合物(leukocyte activation cocktail)，37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2刺激培養(yǎng)4～6 h(每隔2 h混勻1次)，加入10μl CD4-PC5及同型對(duì)照進(jìn)行細(xì)胞表面分子染色，加入溶血素500μl混勻室溫避光10min，PBS洗滌棄上清，經(jīng)固定和破膜后加入20μl IL-17-PC7抗體及同型對(duì)照進(jìn)行胞內(nèi)抗體染色，室溫孵育30 min，加入500μl PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。Th17細(xì)胞水平以CD4+IL-17+表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組組間比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，對(duì)宮頸癌組中不同期別的HPV DNA病毒載量均數(shù)行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，相關(guān)系數(shù)采用Spearman分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HPV檢出率的比較

正常對(duì)照組50例，HPV陽(yáng)性3例，HPV感染陽(yáng)性率為6.0%(3/50)；宮頸癌組50例，HPV陽(yáng)性48例，HPV感染陽(yáng)性率為96.0%(48/50)。兩組HPV檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 HPV病毒載量與宮頸病變分期的關(guān)系

宮頸癌患者中HPV DNA病毒載量均數(shù)在Ⅰ期組中為302.09，Ⅱ期組中為424.22，Ⅲ期組中為619.67，Ⅳ期組中為704.12，對(duì)宮頸癌組中不同期別的HPV DNA病毒載量均數(shù)進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，不同期別的宮頸癌的HPV病毒載量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Hc=7.99，P<0.05)，且隨宮頸癌的FIGO分期期別越高，HPV病毒載量越高。宮頸癌的FIGO分期期別越高，HPV病毒在較高的載量范圍所占百分比越高，HPV DNA病毒載量在宮頸癌Ⅰ期組中有36.4%在中高度載量以上，在宮頸癌Ⅱ期組中有50%在中高度載量以上，在宮頸癌Ⅲ期組有73.3%在中高度載量以上，Ⅳ期組有80%在中高度載量以上。見(jiàn)表1。

表1 不同期別的宮頸癌的HPV病毒載量分布情況 例

Tab 1 Distribution of HPV viral load in different stage cervical cancer cases

注：括號(hào)內(nèi)為所占百分比

2.3 兩組外周血中Th17細(xì)胞水平比較

50例宮頸癌患者外周血Th17細(xì)胞水平為(2.05±0.48)%，50例正常對(duì)照者外周血Th17水平為(0.90±0.28)%；宮頸癌組外周血Th17細(xì)胞水平明顯高于正常對(duì)照組，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.49，P<0.001)。見(jiàn)圖1。

2.4 宮頸癌病理學(xué)特征與外周血中Th17細(xì)胞水平間的關(guān)系

宮頸癌患者外周血中Th17細(xì)胞水平與FIGO分期、HPV病毒感染載量高低及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)有關(guān)(均P<0.001)。宮頸癌患者外周血Th17細(xì)胞水平與FIGO分期呈正相關(guān)(r=0.75，P<0.001)；與HPV病毒載量呈正相關(guān)(r=0.55，P<0.001)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組及有脈管浸潤(rùn)組Th17細(xì)胞表達(dá)水平顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組及無(wú)脈管浸潤(rùn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，外周血Th17細(xì)胞水平與是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)呈正相關(guān)(r值為0.59、0.62，P<0.001)。見(jiàn)表2。

2.5 HPV陰性與陽(yáng)性者外周血中Th17細(xì)胞水平比較

HPV陽(yáng)性組(正常對(duì)照組中HPV感染3例，宮頸癌組中HPV感染48例)外周血Th17細(xì)胞水平為(2.02±0.51)%，HPV陰性組外周血Th17水平為(0.90±0.29)%，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.43,P<0.001)。

3 討 論

新疆是我國(guó)宮頸癌高發(fā)區(qū)，尤其在南疆宮頸癌是當(dāng)?shù)鼐S吾爾族婦女疾病死亡的主要原因之一。高危型人乳頭瘤病毒感染是宮頸癌及癌前病變發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素之一。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組HPV檢出率明顯高于正常對(duì)照組，不同期別的宮頸癌患者HPV病毒載量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨宮頸癌的FIGO分期期別的增高，HPV病毒載量也隨之升高，且宮頸癌患者HPV病毒載量普遍在中高度載量范圍，進(jìn)一步證實(shí)了高危HPV感染在新疆維吾爾族婦女宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著不可忽視的作用。

圖1 兩組淋巴細(xì)胞比率和Th17細(xì)胞比率比較

Fig 1 Percentages of lymphocytes and Th17 cells in two groups

宮頸癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多階段、多步驟的過(guò)程，在HPV病毒持續(xù)感染及多種因素的共同作用下，宮頸鱗狀上皮細(xì)胞受到破壞，并誘導(dǎo)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)平衡失調(diào)，宿主自身的免疫因素對(duì)疾病的發(fā)生發(fā)展起著決定性的作用。Th17細(xì)胞是輔助性T細(xì)胞新亞群，因能夠分泌白介素17(interleukin 17，IL-17)而得名，在自身免疫性疾病及機(jī)體防御反應(yīng)中起到重要作用。目前在多種腫瘤，如胃癌、乳腺癌、卵巢癌、大腸癌、腎癌、非小細(xì)胞肺癌等[5-7]中發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子表達(dá)，但Th17細(xì)胞在腫瘤免疫中發(fā)揮的作用是抗腫瘤，還是促進(jìn)腫瘤發(fā)展，目前仍然結(jié)論不一。

本研究中維吾爾族宮頸癌患者外周血中Th17細(xì)胞水平顯著高于維吾爾族健康對(duì)照組。外周血Th17細(xì)胞水平與宮頸癌FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)有關(guān)，隨臨床分期加重而表達(dá)升高。提示Th17細(xì)胞的表達(dá)隨著宮頸癌惡性程度增加而升高，在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中表現(xiàn)為促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用。Th17細(xì)胞可能是通過(guò)與效應(yīng)性細(xì)胞相互作用、誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生腫瘤免疫監(jiān)視逃逸及促進(jìn)腫瘤血管上皮細(xì)胞生成等機(jī)制參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Numasaki等[8]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)轉(zhuǎn)染IL-17至非小細(xì)胞肺癌腫瘤細(xì)胞中，并將此細(xì)胞種植到SCID小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-17選擇性增強(qiáng)血管生成趨化因子的分泌，促進(jìn)腫瘤血管分布，加速腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。此外，有研究發(fā)現(xiàn)IL-17通過(guò)改變腫瘤細(xì)胞的行為和誘發(fā)腫瘤發(fā)生的中性粒細(xì)胞招募促進(jìn)乳腺腫瘤進(jìn)展[9]。結(jié)腸癌、乳腺癌等多種腫瘤的研究結(jié)果[9-10]顯示，Th17細(xì)胞和IL-17表達(dá)水平與患者的預(yù)后有關(guān)，Th17細(xì)胞水平的升高導(dǎo)致患者死亡率升高、生存期縮短、疾病預(yù)后較差。

在丙型肝炎病毒感染后的病毒清除過(guò)程中特異性Th17細(xì)胞發(fā)揮了一定作用[11]。關(guān)于Th17細(xì)胞水平與宮頸癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究并不多見(jiàn)，而從Th17細(xì)胞水平與HPV感染為研究視角，在新疆維吾爾族宮頸癌患者中研究的尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究顯示Th17細(xì)胞水平與高危型HPV之間的關(guān)系密切，Th17細(xì)胞水平HPV陽(yáng)性組顯著高于HPV陰性組，并且隨HPV病毒載量的升高，Th17細(xì)胞水平也升高，兩者呈正相關(guān)，提示Th17細(xì)胞可能參與清除HPV病毒的作用，HPV載量越高其對(duì)細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用越顯著，但HPV病毒如何誘導(dǎo)Th17細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答尚待進(jìn)一步研究。腫瘤免疫機(jī)制復(fù)雜，尚須擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證此實(shí)驗(yàn)結(jié)果在不同民族及地區(qū)宮頸癌發(fā)生發(fā)展的普遍性。

表2 宮頸癌患者外周血Th17細(xì)胞水平與臨床各項(xiàng)指標(biāo)間的關(guān)系

Tab 2 Relationship between the levels of Th17 cells in peripheral blood and clinical indicators in cervical cancer patients

臨床指標(biāo)nTh17細(xì)胞水平F或t值P值FIGO分期 Ⅰ111.47±0.2121.9620.000 Ⅱ142.02±0.27 Ⅲ152.14±0.29 Ⅳ102.58±0.48HPV病毒載量 低度載量31.48±0.346.3810.001 中度載量151.85±0.33 中高載量232.20±0.33 高度載量72.42±0.70分化程度 高分化131.86±0.41 中分化182.03±0.40 低分化192.20±0.562.0780.136淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有242.32±0.484.5350.000 無(wú)261.80±0.32脈管浸潤(rùn) 有242.33±0.464.9630.000 無(wú)261.78±0.31

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Correlation analysis of high-risk human papilloma virus viral load and the level of Th17 cells in peripheral blood in Uygur women with cervical cancer

ZHANG Yuan1，F(xiàn)ENG Yang-chun2，HUANG Yan-chun2

(1.InstituteofTumorResearch，2.ClinicalLaboratoryDepartment，TumorHospitalAffiliatedtoXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China)

Objective： To investigate the correlation between human papilloma virus(HPV) and Th17 cells in peripheral blood of Uygur patients with cervical cancer.Methods: Peripheral blood was collected from 50 cases of Uygur cervical cancer patients and 50 Uygur healthy people.Hybrid capture Ⅱ method was used to detect viral load of HPV.The percentage of Th17 cells was detected by flow cytometric analysis.Results: The rate of HR-HPV infection was 96.0% in the cervical cancer group，6.0% in healthy control group(P<0.05).The percentages of Th17 cells in cervical cancer group was significantly higher than that in the healthy control group(P<0.05).The percentages of Th17 cells between HPV positive and negative group was statistically significantly different(P<0.05).The expression of Th17 cells in peripheral blood was positively correlated with FIGO stage，lymph node metastasis，and vascular infiltration(r=0.55，0.59，0.62，P<0.001).Conclusion: Th17 cells may play an important role in the development of persistent HPV infection leading to cervical cancer．

cervical cancer；Th17 cell；human papilloma virus；Uygur

2016-03-02

2016-05-26

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015211C133)；新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(腫2014-04)

張園(1982-)，女，河北保定人，助理研究員。E-mail:xj_zhangyuan@163.com

黃艷春 E-mail:huangyanchun0619@sohu.com

張園，馮陽(yáng)春，黃艷春.新疆維吾爾族宮頸癌患者人乳頭瘤病毒感染與外周血中Th17細(xì)胞水平的相關(guān)性研究[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2016，35(5)：699-703.

R737.33

A

1671-6264(2016)05-0699-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2016.05．011