金屬還原酶FreB2對煙曲霉鐵吸收及氧化壓力應答的影響

王偉偉 ， 吳翠嬌*， 趙 巍， 張姍姍， 王 斌

(1.青島大學醫學院 組織學與胚胎學教研室，山東 青島 266071；2.青島大學醫學院 微生物學教研室，山東 青島 266071)

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金屬還原酶FreB2對煙曲霉鐵吸收及氧化壓力應答的影響

王偉偉1， 吳翠嬌1*， 趙 巍2*， 張姍姍1， 王 斌2

(1.青島大學醫學院 組織學與胚胎學教研室，山東 青島 266071；2.青島大學醫學院 微生物學教研室，山東 青島 266071)

利用構建的煙曲霉金屬還原酶基因(AFUA-1G00350，FreB2)缺失突變株，對煙曲霉金屬還原酶基因FreB2功能進行初步研究，為揭示該基因與煙曲霉的致病關系提供依據。比較野生株和基因缺失突變株在AMM和無鐵AMM液體培養基中生長時高鐵還原酶的活性，繪制不同時間野生株和基因缺失突變株在AMM和無鐵AMM液體培養基中生長時高鐵還原酶活性曲線。利用Real-Time PCR方法分析SreA、SidA、FetC、FtrA和FreB這些與鐵的吸收相關基因的mRNA的表達量變化。測定野生株和基因缺失突變株對氧化壓力的敏感性及胞內活性氧物質含量。不論在AMM液體培養基中還是在無鐵AMM液體培養基中培養時，突變株高鐵還原酶的活性都明顯高于野生株高鐵還原酶活性。與野生株相比培養60 h時，突變株SreA、SidA、FetC、FtrA和FreB這些與鐵的吸收相關基因的表達量出現明顯上調。氧化壓力敏感性實驗顯示，基因缺失突變株對H2O2的敏感性顯著增強，同時胞內活性氧物質含量明顯增多。金屬還原酶基因FreB2在煙曲霉鐵吸收及氧化壓力應答過程中發揮作用；煙曲霉與鐵吸收相關基因之間存在功能互補效應。

煙曲霉；金屬還原酶；Real-Time PCR；活性氧物質

煙曲霉是最常見的通過空氣傳播的條件致病菌[1]。鐵是微生物必須的微量元素，鐵離子的氧化還原特性使其能夠作為許多關鍵酶類的輔助因子參與細胞內一系列重要的代謝過程[2-3]。鐵離子濃度與煙曲霉的生長和致病性密切相關[4]。煙曲霉菌從宿主體內獲得鐵的能力是其致病性的重要條件[5]。在人體內，鐵通常以乳鐵蛋白或載鐵蛋白的形式存在，且哺乳動物的免疫系統有通過限制鐵的可利用率來抵抗微生物感染的機制，因此形成了天然的低鐵環境[6-7]。為從宿主獲得鐵這種微量元素，煙曲霉形成了兩種鐵吸收途徑，包括高親和性鐵吸收系統(RIA)和轉鐵載體吸收系統，這兩種系統在菌體處于缺鐵環境時都被誘導表達[8]。在轉鐵載體吸收系統中，兩種轉鐵載體fusarinine C (FcS)和triacetylfusarinine C (TAFC)在鳥氨酸單氧酶的作用下被合成[9]。FcS和TAFC負責收集細胞外的鐵離子，然后被轉運蛋白轉運到細胞內[10]。在RIA系統中，質膜上的金屬還原酶等先將不溶性Fe3+還原為可溶性的Fe2+[11]，然后Fe2+被高親和性轉鐵載體和鐵氧化還原酶蛋白復合物轉運到細胞內[12-13]。因此，金屬還原酶還原過程是煙曲霉RIA系統攝取鐵關鍵的第一步。目前已知在這兩種鐵吸收系統中起作用的基因見表1。

煙曲霉共有15種編碼金屬還原酶的基因，但目前對這些基因功能和結構的分析很少[14]。僅有FreB一種基因被證實在煙曲霉鐵缺乏時和鐵的吸收相關[11]。本研究選取金屬還原酶基因AFUA-1G00350進行研究,并將其命名為FreB2。

表1 煙曲霉鐵吸收相關基因

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 煙曲霉野生菌株Af293(W2)為美國辛辛納提大學病理和實驗醫學系Judith C Rhodes教授惠贈；金屬還原酶基因FreB2缺失突變菌株(ΔFreB2)為本實驗室構建。

1.1.2 培養基 曲霉菌基礎液體培養基(AspergillusMinimal Medium，AMM)，AMM固體平板，YG培養基的配制見文獻[15]。無鐵AMM除不加鐵鹽外與AMM培養基相同。

1.1.3 主要試劑及儀器 Bathophenanthroline disulphonate(BPS，美國Sigma公司)；PCR相關試劑(大連寶生物工程有限公司)；FermentasTaq2×Mix(MBI公司)；trizol(日本TaKaRa公司)；反轉錄試劑盒(北京全式金公司)；熒光定量染料(北京康為世紀公司)；二氯熒光素(DCFH-DA,美國Sigma公司)；其他試劑均為國產分析純；酶標儀(Tecan SUNRISE，瑞士)；熒光顯微鏡(Olypums DP80，日本)；羅氏Lightcycler 96 qPCR儀(瑞士Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 Fe2+濃度與吸光值標準曲線 分別向100 μL 2 mmol/L BPS溶液中加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 μL 濃度為1 mmol/L的FeSO4溶液，然后加入無菌雙蒸水使溶液總體積達200 μL。37 ℃避光孵育1 h后于535 nm波長下測定溶液吸光值。根據不同 Fe2+濃度對應的吸光值繪制Fe2+濃度與吸光值標準曲線，得出Fe2+濃度與對應吸光值之間的函數關系。

1.2.2 金屬還原酶活性測定 采用Nyhus等[16]文章中使用的方法，將W2和ΔFreB2菌株的孢子以1.0×106個/mL濃度分別接種于100 mL AMM和無鐵AMM液體培養基，200 r/min、37 ℃恒溫搖床震蕩培養。在接種12、24、36、48、60、72 h時測量高鐵還原酶活性。測量時取包含等量菌體的1 mL菌液，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，吸出500 μL上清，將剩余500 μL菌液混勻。分別向上清和菌液中加入250 μL 4 mmol/L BPS和250 μL 4 mmol/L HEDTA-Fe3+。37 ℃避光孵育1 h后在535 nm波長下測定吸光值。根據Fe2+濃度與吸光值標準曲線，得出Fe2+濃度。金屬還原酶活性：(nmol Fe2+/mL/h)=(c菌液Fe2+-c上清Fe2+)/ t。

c：從Fe2+濃度與吸光值標準曲線得出的Fe2+濃度，t：加入BPS和HEDTA-Fe3+后的孵育時間。

1.2.3 Real-time PCR法檢測鐵吸收相關基因的表達 將W2和ΔFreB2菌株的孢子以1.0×106個/mL濃度分別接種于5 mL AMM和5 mL無鐵AMM液體培養基，300 r/min、37 ℃恒溫搖床震蕩培養。60 h時收集并干燥菌體，采用液氮研磨法破碎菌體后加trizol提取總RNA?？俁NA用反轉錄試劑盒轉錄為cDNA，再以cDNA為模版擴增。擴增引物均由上海生工生物工程有限公司設計和合成。內參為GAPDH，內參引物為上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表2。反應參數：95 ℃預變性1 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，共40個循環。以雙ΔCt法計算各組基因與內參的比值。

表2 本研究所用引物

1.2.4 氧化壓力敏感性測定 采用5倍稀釋法用無菌雙蒸水依次將W2和ΔFreB2菌株的孢子濃度調整為4×105、8×104、1.6×104、3.2×103、6.4×102個/μL。分別向以上5個濃度的W2和ΔFreB2菌株孢子懸液中加入等體積H2O2，使H2O2終濃度分別為100、200、300、400、500 mmol/L，對照組將H2O2改為等體積PBS, 30 ℃孵育30 min。取5 μL處理后的各濃度W2和ΔFreB2菌株孢子懸液進行點板實驗，點板所用培養基為AMM固體培養基。待點板菌液完全滲透后將各平板于37 ℃恒溫培養箱倒置培養48～72 h，觀察各菌株生長情況。

1.2.5 活性氧物質含量測定 將W2和ΔFreB2菌株的孢子以4.0×105個/mL濃度接種于YG液體培養基，混勻后以每孔200 μL接入96孔板，30 ℃培養12 h。用PBS清洗2次，分別加入濃度為100、200 mmol/L的H2O2200 μL/孔，30 ℃恒溫孵育30 min后用PBS清洗2次，加入40 μmol/L DCFH-DA 50 μL/孔，37 ℃恒溫避光孵育30 min，PBS清洗2次后置于熒光顯微鏡下觀察。在熒光檢測過程中選擇多個視野進行細胞計數，分別記錄總細胞數(N)和綠色熒光細胞數(Nf)，以此計算活性氧物質(ROS)陽性細胞的百分率(%)：

ROS陽性細胞百分率(%)=(Nf/N)×100%

2 結果與分析

2.1 Fe2+濃度與吸光值標準曲線

繪制 Fe2+濃度與吸光值標準曲線如圖1所示，得出Fe2+濃度(x)與吸光值(y)之間的函數關系式為y=0.047 6x-0.007 4。

圖1 二價鐵濃度與吸光值標準曲線

2.2 金屬還原酶活性

不同時間點和不同培養基培養的W2和ΔFreB2菌體內，金屬還原酶活性不同。無鐵AMM培養基培養時，ΔFreB2菌株在12～72 h間金屬還原酶活性始終高于W2，且和W2菌株一樣在36 h左右達到峰值。AMM培養基培養時，在24～72 h間ΔFreB2菌株金屬還原酶活性高于W2，在60 h左右活性達到峰值(見圖2)。

2.3 與鐵吸收相關基因的mRNA表達變化

由圖3可見，無論在無鐵AMM培養基還是AMM培養基中，與W2菌株相比，ΔFreB2菌株與鐵吸收相關基因MirB、SreA、SidA、FetC、FreB的表達量都出現上調，差異有顯著性。

圖2 不同菌株各時間點金屬還原酶活性曲線Fig.2 The curve of metalloreductase activity of different strains over time

2.4 對氧化壓力的敏感性

由圖4可知，在AMM固體平板培養下，對照組W2菌株與ΔFreB2菌株生長情況無明顯差異。而將W2菌株和ΔFreB2菌株孢子分別用不同濃度H2O2處理后，W2和ΔFreB2菌株的生長都受到不同程度的影響，但ΔFreB2菌株與W2菌株相比生長缺陷更明顯，特別是H2O2濃度為100和200 mmol/L處理組。當H2O2濃度升為300、400和500 mmol/L時，W2和ΔFreB2菌株的生長都受到明顯影響。ΔFreB2菌株與W2菌株相比，對H2O2的敏感性增強。

圖3 與鐵吸收相關基因的mRNA表達變化

2.5 活性氧物質含量

研究結果顯示，未用H2O2處理時W2菌株和ΔFreB2菌株胞內均無明顯的ROS產生現象，沒有表現出熒光，如圖5A。H2O2處理后ΔFreB2菌株中ROS陽性細胞數明顯增多(圖5D)。在100 mmol/L H2O2處理組(圖5B)，ΔFreB2菌株ROS陽性細胞率為60%～70%，而W2菌株ROS陽性細胞率只有20%左右。在200 mmol/L H2O2處理組(圖5C)，W2菌株和ΔFreB2菌株相比100 mmol/L H2O2處理組ROS陽性細胞率均有所升高，W2菌株為50%～60%，ΔFreB2菌株達到95%以上，ΔFreB2菌株ROS陽性細胞率仍明顯高于W2菌株。

圖4 W2菌株和ΔFreB2菌株對氧化壓力的敏感性測定

Fig.4 The sensitivity of W2 and ΔFreB2 strains to oxidative stress

A：對照組；B：100 mmol/L H2O2處理組；C：200 mmol/L H2O2處理組；D：300 mmol/L H2O2處理組；E：400 mmol/L H2O2處理組；F：500 mmol/L H2O2處理組

A： untreated control；B：100 mmol/L H2O2treatment；C：200 mmol/L H2O2treatment；D：300 mmol/L H2O2treatment；E：400 mmol/L H2O2treatment；F：500 mmol/L H2O2treatment

圖5 W2菌株和ΔFreB2菌株胞內活性氧物質測定

3 討 論

鐵離子作為人體必需的營養元素之一，是煙曲霉在宿主體內定殖、擴散及侵染等過程的重要決定因素。在對本金屬還原酶基因FreB2的初步研究中發現，僅敲除該金屬還原酶基因FreB2，突變株菌落及菌絲生長狀況與野生型相比無明顯變化[17]。本研究檢測出ΔFreB2菌株金屬還原酶活性比野生株高，且在無鐵AMM中，野生株和ΔFreB2突變株金屬還原酶活性峰值較AMM出現早。推測其原因可能是FreB2的缺失導致了其他鐵吸收相關基因表達的改變。因此，選取了幾個目前已知具有重要功能的鐵吸收相關基因，檢測其表達量。熒光定量PCR結果顯示，相同培養條件下，突變株鐵吸收相關基因如MirB、FetC、SidA、FreB的表達量均出現明顯上調。由此得出可能是FreB2的缺失引起了突變株其他金屬還原酶如FreB等表達量的升高。而這些鐵吸收相關基因又受無鐵環境誘導，所以導致金屬還原酶基因在無鐵AMM中的表達早于AMM。同時該結果也表明煙曲霉與鐵吸收相關基因之間存在著一定的協同作用?；蛟S這也是導致初步研究該基因功能時突變株菌落及菌絲生長狀況與野生型相比無明顯變化的原因。

煙曲霉的氧化壓力應答機制是該病原真菌在各種環境壓力條件下存活并正常生長代謝的重要保障。H2O2作為常用的凋亡誘導劑能夠誘導真菌凋亡，細胞受氧化壓力刺激后產生的ROS也可參與多種信號途徑的活化，導致細胞凋亡[18-19]。已有報道，外源氧化劑存在的條件下細胞內DNA的損傷可能與細胞內可利用的鐵離子濃度有關[2-3]。因為鐵離子能夠與細胞內的氧化成分如過氧化氫發生芬頓反應，產生氧自由基，誘導細胞凋亡[2-3]。本研究發現，ΔFreB2菌株對氧化壓力的敏感性及ROS陽性細胞率均高于野生株。分析其原因，可能是由于表達量增多的其他高鐵還原酶將更多的Fe3+還原成Fe2+，進而與過氧化氫發生芬頓反應，造成胞內ROS含量的上升，導致細胞凋亡。

本研究結果表明，煙曲霉金屬還原酶基因FreB2與鐵的吸收相關，且與鐵吸收相關基因之間存在功能互補效應；該基因在氧化壓力應答過程中也發揮重要的作用。至于該金屬還原酶是如何參與氧化壓力應答過程以及鐵吸收相關基因之間具體的相互作用機制則還需要后續實驗進一步證明。

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The Effects of Metalloreductase FreB2 on the Uptake of Iron and Response to Oxidative Stress inAspergillusfumigatus

WANG Wei-wei1, WU Cui-jiao1, ZHAO Wei2, ZHANG Shan-shan1, WANG Bin2

(1.Dept.ofHistol. &Embryol., 2.Dept.ofMicrobiol.,MedicalColl.QingdaoUni.,Qingdao266071)

The function of a metalloreductase gene FreB2 ofAspergillusfumigatuswas initially studied by the establishment of metalloreductase gene (AFUA-1G00350, FreB2) deletion mutant strain ofA.fumigatus, in order to explore the pathogenic relation ofA.fumigatusand the gene to provide foundation. The metalloreductase activity of wild type strain and gene deletion strain ofA.fumigatuswere compared in AMM and iron free AMM medium liquid during their growth for the activity of metalloreductase, and draw the metalloreductase activity curve of the wild type strain and gene deletion strain in AMM and iron free AMM liquid medium during their growth. Using Real-Time PCR to analyze the mRNA expression variation of SreA, SidA, FetC, FtrA, and FreB these related genes to iron assimilation was significantly up regulated. The sensitivity to oxidation stress experiment showed that the sensitivity of gene deletion mutant strain to H2O2was significantly strengthened, at the same time the intracellular active oxygen substance significantly increased. Metalloreductase FreB2 played role during the process of iron assimilation and oxidation stress response ofA.fumigatus; therefore, there existed a functionally mutual complementary effect onA.fumigatusand iron assimilation related genes.

Aspergillusfumigatus; metalloreductase; real-time PCR; ROS

國家自然科學基金項目(30840014)；教育部留學回國基金和山東省自然科學基金項目(ZR2010CM011)

王偉偉 女，碩士研究生。研究方向為細胞生物學。E-mail：weiweiw0212@126.com

* 通訊作者。吳翠嬌 女，博士,碩士生導師。研究方向為組織學與胚胎學。Tel:0532-83780060, E-mail：wucjzr@163.com

2015-12-23；

2016-01-05

Q756；R379.6

A

1005-7021(2016)02-0008-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.02.002

趙巍 女，博士,碩士生導師。研究方向為微生物學。Tel:0532-83780059, E-mail：qduzhaowei@163.com