不同強度運動聯合中藥對葡萄糖耐量減退大鼠血管內皮功能的影響

倪英群，方朝暉

國家中醫臨床研究糖尿病基地，安徽中醫藥大學第一附屬醫院，安徽 合肥 230031

不同強度運動聯合中藥對葡萄糖耐量減退大鼠血管內皮功能的影響

倪英群，方朝暉

國家中醫臨床研究糖尿病基地，安徽中醫藥大學第一附屬醫院，安徽 合肥 230031

目的 觀察不同強度運動聯合中藥對葡萄糖耐量減退（IGT）大鼠過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α（PGC-1α）的表達及血管內皮功能的影響，探討不同強度運動與中藥聯合的協同作用及其機制。方法 健康雄性SD大鼠70只，隨機取10只為空白組予以常規飼料喂養，其余60只大鼠予以高糖高脂飼料喂養進行造模。將成模大鼠隨機分為模型組、單純中藥組（中藥組）、低強度運動＋中藥組（低強度組）、中強度運動＋中藥組（中強度組）、高強度運動＋中藥組（高強度組），每組10只。空白組、模型組、中藥組每日自由活動，運動各組進行不同強度跑臺運動，同時給予丹蛭降糖膠囊灌胃。比較干預前后一氧化氮（NO）、內皮型一氧化氮合酶（eNOS）、血管性假血友病因子（vWF）和血漿內皮微粒（EMP）變化；檢測各組PGC-1α水平。結果 與空白組比較，模型組NO、eNOS、PGC-1α水平下降，vWF、EMP水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，各干預組NO、eNOS、PGC-1α水平升高，vWF、EMP水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。結論 中等強度運動聯合丹蛭降糖膠囊能有效改善血管內皮功能。

不同強度運動；葡萄糖耐量減退；過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α；中藥；大鼠

糖尿病是臨床常見的內分泌代謝紊亂癥，以血管內皮損傷為基礎的并發癥給患者帶來諸多危害。有研究表明，在糖尿病早期糖耐量受損（IGT）階段血管內皮功能就已處于失調狀態[1-2]。過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α（PGC-1α）在線粒體生物合成過程中起重要作用，影響細胞的能量代謝及細胞凋亡，在血管重建及胰島素抵抗等方面具有調節作用。前期研究表明，運動聯合丹蛭降糖膠囊可對抗氧化應激，改善胰島功能[3]。本實驗以IGT大鼠為研究對象，觀察丹蛭降糖膠囊聯合不同強度運動干預下PGC-1α的表達及血清一氧化氮（NO）、內皮型一氧化氮合酶（eNOS）、血管性假血友病因子（vWF）水平、血漿內皮微粒（EMP）的變化，探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

清潔級健康雄性SD大鼠70只，4～5周齡，體質量140～160 g，安徽中醫藥大學實驗動物中心，合格證號SCXK（皖）2012-001。室溫（23±2）℃、濕度40%～60%，晝夜明暗12 h/12 h交替，自由飲水，分籠飼養，適應性喂養1周。

1.2 藥物

丹蛭降糖膠囊由太子參、生地黃、牡丹皮、菟絲子、澤瀉、水蛭等組成，安徽中醫藥大學第一附屬醫院制劑室提供，批號20140526，每粒含原藥材0.5 g。

1.3 主要試劑與儀器

NO、NOS測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；vWF測定試劑盒，上海軒吳科技公司；EMP抗體，美國BCI公司；PGC-1α試劑盒，美國ADL公司。Teacan Infinite M200酶標儀、洗板機wellwash4MK-2（芬蘭），流式細胞儀（美國BD公司），PCR儀（美國Bio-RAD），凝膠成像分析系統（美國SYNGENE）。

2 實驗方法

2.1 造模和分組

適應性飼養1周后，隨機選取10只為空白組，予以常規飼料（13.4 kJ/g）喂養，其余60只大鼠予以高糖高脂飼料（21.8 kJ/g）喂養。12周時行口服葡萄糖耐量試驗（OGTT），禁食8 h鼠尾采血測空腹血糖（FBG），50%葡萄糖注射液2 g/kg灌胃，2 h后再次鼠尾采血測餐后2 h血糖（2 h PG），以7.8 mmol/L≤2 h PG＜11.1 mmol/L并持續1周以上為IGT造模成功，實際成模50只。將成模大鼠隨機分為模型組、單純中藥組（中藥組）、低強度運動＋中藥組（低強度組）、中強度運動＋中藥組（中強度組）、高強度運動＋中藥組（高強度組），每組10只。由于高血糖、運動等原因造成實驗中大鼠少量死亡及丟失，最終空白組10只、模型組8只、中藥組9只、低強度組9只、中強度組10只、高強度組9只。

2.2 給藥

空白組、模型組和中藥組每日自由活動；中藥組予丹蛭降糖藥液灌胃，給藥劑量按臨床成人劑量的12倍即1.08 g/kg灌胃，每日1次；運動各組大鼠每日10 m/min×10 min適應性跑臺訓練。正式治療開始后，負荷強度依據Bedford等[4]推薦，即低強度組跑速為10 m/min（約30%VO2max），坡度為0°；中強度組為15 m/min（約50%VO2max），初始跑速為12 m/min，持續30 min，坡度為0°，以后運動坡度為5°，每隔1 d速度增加1 m/min，運動時間增加10 min，直至增至15 m/min，時間為1 h；高強度組為20 m/min（約70%VO2max），初始跑速為15 m/min持續30 min，坡度為0°，以后運動坡度為5°，每隔1 d速度增加1 m/min，運動時間增加10 min，1周增至20 m/min，時間為1 h，或以大鼠在跑臺上出現頑固性拒跑現象，則停止跑臺運動。運動各組運動時間每周5 d，每日1次。其余時間自由活動，期間不改變膳食方案，同時予丹蛭降糖藥液1.08 g/kg灌胃,每日1次。

2.3 觀察指標

2.3.1 一氧化氮和血管性假血友病因子檢測 第18周末干預結束后禁食12 h，10%水合氯醛0.5 mL/100 g大鼠腹腔注射麻醉，腹主動脈取血3 mL，室溫靜置1 h，3000 r/min離心20 min，分離血清后-80 ℃冰箱保存備用，按試劑說明書進行操作。

2.3.2 內皮微粒檢測 大鼠麻醉后腹主動脈采血3 mL，置于抗凝管中，參考文獻[5]測定，EMP＜1.0 μm且CD31+/CD42-的微粒，采用流式細胞儀檢測。

2.3.3 過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α檢測 大鼠麻醉取腹主動脈約4 cm長，PBS沖凈，濾紙吸干放入凍存管，然后迅速投入液氮中，置-80 ℃冰箱保存備用。用Trizol提取總RNA，反轉錄成cDNA，PCR反應。PGC-1α引物由上海英駿生物技術服務有限公司合成。上游5'-TCAGTCCTCACTG GTGGACA-3'，下游3'-TGCTTCGTCGTCAAAAACA G-3'，產物長度126 bp。反應條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性1 min，51 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃再延伸5 min。1%瓊脂凝膠電泳，然后用凝膠成像系統觀察。

3 統計學方法

4 結果

4.1 丹蛭降糖膠囊聯合不同強度運動干預對模型大鼠血清一氧化氮、內皮型一氧化氮合酶、血管性假血友病因子和內皮微粒水平的影響

與空白組比較，模型組NO、eNOS、vWF和EMP水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，低強度組、高強度組、中藥組NO、eNOS水平顯著升高及vWF、EMP水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。結果見表1。

表1 各組大鼠血清NO、eNOS、vWF和EMP水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清NO、eNOS、vWF和EMP水平比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01（下同）

組別 只數 NO/（μmol/L）eNOS/（ng/mL）vWF/（mU/mL）EMP/（個/μL）空白組 10 9.25±3.16 25.46±6.07 58.57±10.75 268.52±36.54模型組 8 4.56±1.93*9.87±3.49*90.53±18.14*781.62±60.23*低強度組 9 6.72±2.09#22.67±3.76#70.42±15.60#384.56±41.78#中強度組10 9.16±2.78##23.16±5.80##62.37±12.86##321.89±46.36##高強度組 9 8.09±3.11#20.75±11.05#66.81±14.01#452.62±66.12#中藥組 9 7.23±2.92#20.63±10.88#63.75±13.91#402.56±51.21#

4.2 丹蛭降糖膠囊聯合不同強度運動干預對模型大鼠過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α表達的影響

與空白組比較，模型組PGC-1α表達水平明顯下降（P＜0.05）；低強度組、中強度組、高強度組和中藥組PGC-1α表達較模型組顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。結果見圖1。

圖1 各組大鼠PGC-1α基因表達

5 討論

糖尿病血管內皮損傷是多因素、多種病理機制所致，是影響患者預后的關鍵因素。NO是重要的調節血管張力的物質，具有舒張血管作用。高血糖可使血管內皮NO合成系統紊亂，損壞內皮細胞產生eNOS，使NO的生成減少，導致血管內皮功能的障礙。EMP是血管內皮在激活或凋亡時細胞膜脫落的小囊泡，其直徑在0.1～l μm，攜帶著某些特異性抗原，糖尿病患者EMP水平明顯升高。EMP的釋放一方面負反饋于內皮系統，促進內皮損傷；另一方面，釋放的EMP可降低eNOS的活性，減少NO生成，加速內皮損傷。EMP與血管病變的發生發展有著密切的相關性，是血管損傷、內皮細胞功能障礙的新興生物標志物。這2個敏感性指標可直接反映血管內皮損傷的程度，有助于及時了解內皮功能動態變化。來自于血管內皮細胞的糖蛋白vWF，作為Ⅷ因子的載體，當血管內皮細胞受到損傷時，內皮細胞中vWF因子進入血液，促進血小板的聚集并黏附于受損的血管內皮細胞，在血栓形成過程中起關鍵作用。該指標可幫助判定糖尿病血管并發癥發生的早晚及其嚴重程度。本實驗結果顯示，給予模型大鼠不同強度的運動并聯合中藥，可使血清eNOS、NO含量升高，血清vWF、EMP含量降低，并且這一結果與運動強度具有相關性。與單純中藥組及高強度組比較，中等強度運動更有助于改善血管內皮功能，說明適當運動有助于中藥作用的充分發揮，與中藥聯合具有效果協同作用。

糖尿病的發生及血管內皮損傷與能量代謝有著密切的聯系。線粒體是機體能量代謝的中心，參與多種生理過程，而線粒體的生成關系著線粒體的功能。在線粒體的生成過程中PGC-1α起著關鍵作用。PGC-1α可通過增加骨骼肌長鏈脂肪酸肌纖維膜線粒體膜的表達，促進線粒體脂肪酸氧化，提高胰島素敏感性；另一方面可抑制脂肪酸誘導活性氧產生進而減少內皮細胞的凋亡，改善內皮狀態。PGC-1α表達水平下降會顯著降低線粒體呼吸率，降低生成ATP的能力。因此，PGC-1α水平的表達可直接反映能量代謝及內皮凋亡的變化。本研究結果表明，運動可增強中藥對PGC-1α的表達調節，具有協同促進作用，而中等強度組療效最為顯著。

運動可增加機體能量消耗，使肌肉組織攝取葡萄糖增加。本研究結果進一步表明運動強度變化可調整胰島素受體的表達，但運動強度并不是越大越好。中等強度的運動訓練可使骨骼肌產生良好的適應性。這也與中醫辨證思想“過猶不及”“中病即止”相一致。相對于高強度運動，中、低強度運動更能有效地控制血糖，改善糖尿病患者血管內皮功能，可作為防治糖尿病及血管并發癥的有效手段。

[1] 于萍,李強,劉穎,等.2型糖尿病早期血管內皮功能變化的研究[J].中國實用內科雜志,2010,30(9)：827-828.

[2] 程森華,方朝暉.氧化應激對糖尿病血管內皮的損傷機制及中醫藥干預研究[J].中醫藥臨床雜志,2012,24(2)：163-165.

[3] 方朝暉.丹蛭降糖膠囊聯合運動對糖尿病大鼠胰腺NAPDH氧化酶亞單位p22phox表達水平的影響[J].中國中西醫結合雜志,2013,33(5)：641-645.

[4] BEDFORD T G, TIPTON C M, WILSON N C, et al. Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various exper-imental procedures[J]. J Appl Physiol,1979,47(6)：1278-1283.

[5] BERNAL-MIZRACHI L, JY W, JIMENEZ J, et al. High levels of eirculating endothelial microparticles in patients with acute coronary syndromes[J]. Am Heart J,2003,145(8)：962-970.

Effects of Sports with Different Strength Combined with Traditional Chinese Medicine on

Function of Vascular Endothelium of IGT Rats

NI Ying-qun, FANG Zhao-hui (National Diabetic Base of

Clinical Research of Chinese Medical Science, First Affiliated Hospital of Anhui University of TCM, Hefei 230031, China)

Objective To observe the effects of sports with different strength combined with traditional Chinese medicine on expression of PGC-1α and function of vascular endothelium of IGT rats; To discuss the synergistic action and its mechanism. Methods Seventy healthy male SD rats were randomly divided into blank group (10 rats), which were given regular diet, and the other 60 rats were given high-glucose and high-lipoid diet to establish the IGT model rats, which were then randomly divided into 5 groups, including IGT model group (model group), simple Chinese medicine group (Chinese medicine group), low strength sports+Chinese medicine (low strength group), middle strength+Chinese medicine (middle strength group), and high strength sports+Chinese medicine groups (high strength group), 10 rats in each group. Rats in blank group, model group and Chinese medicine group exercised freely. While rats in different sport strength groups conducted treadmill exercise with different strength, and were given Danzhi Jiangtang Capsules for gavage. Changes of NO, eNOS, vWF and EMP before and after the treatment were compared, the PGC-1α level was detected. Results Compared with the blank group, levels of NO, eNOS and PGC-1α decreased, while the levels of vWF and EMP increased in model group (P<0.05). Compared with the model group, levels of NO, eNOS and PGC-1α increased in all treatment groups, while the levels of vWF and EMP decreased (P<0.05, P<0.01). Conclusion Middle strength sports combined with Danzhi Jiangtang Capsules may effectively improve function of vascular endothelium.

sports with different strength; glucose tolerance subsiding; PGC-1α; traditional Chinese medicine; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.014

R285.5

A

1005-5304(2016)04-0054-04

2015-07-04）

（

2015-08-24；編輯：華強）

國家科技重大專項-重大新藥創制（2010ZX09102）；國家中醫臨床研究基地業務建設科研專項（JDZX201201）；國家中醫藥管理局中醫藥重點學科（20091221）；國家中醫藥管理局國家基本公共衛生服務項目（20131012）；安徽省教育廳高校自然科學研究項目（KJ2015A136）