太芪培元顆粒體外抗HIV-1病毒活性研究

馬秀蘭，馬建萍，張穎，艾合買提·阿不都熱依木，李靜茹，曾琳，鄭永唐，楊柳萌，馬麗雪

1.新疆醫科大學附屬中醫醫院，國家中醫臨床研究基地艾滋病研究室，新疆 烏魯木齊 830000；2.中國科學院昆明動物研究所分子免疫藥理學實驗室，云南 昆明 650223

太芪培元顆粒體外抗HIV-1病毒活性研究

馬秀蘭1，馬建萍1，張穎1，艾合買提·阿不都熱依木1，李靜茹1，曾琳1，鄭永唐2，楊柳萌2，馬麗雪2

1.新疆醫科大學附屬中醫醫院，國家中醫臨床研究基地艾滋病研究室，新疆 烏魯木齊 830000；2.中國科學院昆明動物研究所分子免疫藥理學實驗室，云南 昆明 650223

目的 評價太芪培元顆粒體外對HIV-1病毒的抑制活性。方法 MTT法檢測太芪培元顆粒細胞毒性；通過細胞病變法檢測太芪培元顆粒對HIV-1急性感染的抑制活性；應用HIV-1 p24抗原ELISA檢測太芪培元顆粒對HIV-1急性感染細胞中病毒復制的抑制活性，并計算藥物治療指數。結果 太芪培元顆粒細胞毒性實驗CC50為（3.761±0.370）mg/mL；合胞體抑制實驗EC50為（0.454 5±0.204 6）mg/mL，治療指數為5.84～12.97；p24抑制實驗EC50為（0.56±0.27）mg/mL，治療指數為5.30～8.74。結論 太芪培元顆粒體外抗HIV-1活性較弱。

太芪培元顆粒；人類免疫缺陷病毒；體外抗病毒活性；免疫機制

艾滋病又稱獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS），是由人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）引起的傳染性疾病，以嚴重損害全身免疫系統為特征。目前，抗HIV藥物依然是AIDS防治的主要手段。太芪培元顆粒是新疆醫科大學附屬中醫醫院院內制劑，其主要功效為益氣養陰、補益脾腎，臨床主要用于治療AIDS證屬氣陰兩虛、肺腎不足者。經長期臨床觀察發現，該制劑可明顯改善AIDS患者癥狀，提高其生存質量，對患者CD4+T淋巴細胞水平有提高作用[1-6]。本實驗通過太芪培元顆粒體外抗HIV-1病毒活性的研究，為該藥作用機制研究提供參考。

1 實驗材料

1.1 細胞和病毒

人T淋巴細胞系C8166和HIV-1實驗株HIV-1ⅢB，英國Medical Research Council AIDS Reagent Project惠贈。按常規方法制備HIV-1ⅢB，滴定并計算病毒半數組織培養感染劑量（TCID50）。將病毒貯存液進行分裝，-70 ℃保存。實驗過程中細胞和病毒按照常規方法進行凍存及復蘇。

1.2 藥物

太芪培元顆粒，新疆華世丹藥業股份有限公司，批號130808。疊氮胸苷(3'-Azido-3'-deoxythymidine，AZT)，Sigma公司。

1.3 主要試劑與儀器

HEPES、MTT、DMF、青霉素、硫酸鏈霉素、谷氨酰胺，Sigma公司；2-巰基乙醇，Bio-Rad公司；RPMI-1640和胎牛血清，Gibco公司。酶標儀ELX-800（BIO-TEK），微量移液器（Gilson），二級生物安全柜Froma ClassⅡ、CO2細胞培養箱（Thermo Fisher）。

2 實驗方法

2.1 HIV-1感染性滴定

HIV-1ⅢB按Johnson＆Byington所述方法改良進行滴定，按Reed＆Muench方法計算病毒的TCID50[7]。

2.2 C8166細胞毒性實驗

將100 μL C8166細胞懸液（4×105/mL）與不同濃度待測藥物溶液混合，設3個重復孔。同時設置不含任何藥物的對照孔，MTT法檢測細胞毒性。于酶標儀570 nm波長處測定光密度（OD）值（參考波長630 nm），計算得到對50%細胞產生毒性時的化合物濃度（CC50），即對50%正常T淋巴細胞系C8166細胞產生毒性時的藥物濃度。計量資料以±s表示，按Reed＆Muench法計算CC50。

2.3 HIV-1ⅢB致細胞病變抑制實驗

按100 μL/孔梯度倍比加稀釋藥物于96孔培養板，再將8×105/mL C8166細胞50 μL/孔接種至培養板，加50 μL HIV-1ⅢB稀釋上清液，1300 TCID50/孔。設置重復孔3個，同時以不含任何藥物正常細胞作為對照孔。陽性藥物對照為AZT。37 ℃、5%CO2培養3 d，100倍倒置顯微鏡下對合胞體形成計數。50%有效濃度（EC50）為抑制合胞體形成50%時的藥物濃度。計量資料以±s表示，按Reed＆Muench法計算EC50。

2.4 HIV-1ⅢB急性感染C8166細胞中病毒復制抑制實驗

將4×105個/mL C8166細胞與HIV-1ⅢB（MOI＝0.04）、HIV-1RF（MOI＝0.4）37 ℃感染2 h，1500 r/min離心，PBS洗滌3次，去除游離的病毒離子，取100 μL細胞接種至含100 μL不同稀釋度待測化合物96孔板，37 ℃、5%CO2培養3 d。將培養上清液3000 r/min離心后收集，用終濃度0.5%Triton X-100裂解滅活。采用捕獲p24抗原ELISA檢測。2 μL/板抗鼠IgG-Fc抗體4 ℃鋪板過夜；5%脫脂奶粉4 ℃封板過夜；加自制的鼠抗p24單抗100 μL/孔，置37 ℃溫育60 min；加100 μL/孔裂解感染細胞培養上清，37 ℃、2 h；加100 μL/孔1∶100稀釋的自制兔抗p24多抗，置37 ℃溫育；加100 μL/孔1∶20 000稀釋的羊抗兔IgG-HRP，置37 ℃溫育；加OPD底物反應液。10 min后，2 mol/L硫酸終止反應。ELISA測定OD值，測定波長為490 nm，參考波長630 nm。計量資料以±s表示，計算p24抗原抑制率。

3 結果

3.1 太芪培元顆粒的細胞毒性作用

太芪培元顆粒組CC50值為（3.761±0.370）mg/mL，明顯高于AZT組（1371.37 μg/mL）。結果見表1。

表1 2組不同濃度C8166細胞毒性比較（±s）

表1 2組不同濃度C8166細胞毒性比較（±s）

組別 濃度 細胞存活率/% CC50太芪培元顆粒組5 mg/mL 22.62± 4.39 2.5 mg/mL 75.80± 0.47 1.25 mg/mL 100.47± 2.33 0.625 mg/mL 106.01± 1.73 0.312 5 mg/mL 100.47±11.11 0.156 25 mg/mL 87.15± 2.20陽性藥組 2 μg/mL 39.33± 1.20（3.761±0.370）mg/mL 0.4 μg/mL 84.83± 2.50 0.08 μg/mL 112.17± 1.50 0.016 μg/mL 115.11± 1.50 0.003 2 μg/mL 115.90± 1.40 0.000 64 μg/mL 108.26± 6.70 1371.37 μg/mL

3.2 太芪培元顆粒對HIV-1ⅢB誘導C8166細胞病變的抑制作用

太芪培元顆粒組EC50值為（0.454 5±0.204 6）mg/mL與AZT組（0.458 5±0.371 6）mg/mL比較差異不明顯。結果見表2。

表2 2組不同濃度HIV-1ⅢB誘導C8166細胞病變抑制作用比較（±s）

表2 2組不同濃度HIV-1ⅢB誘導C8166細胞病變抑制作用比較（±s）

組別 濃度 細胞病變抑制率/% EC50/（mg/mL）太芪培元顆粒組5 mg/mL 100 1 mg/mL 83.20±3.18 0.2 mg/mL 37.60±4.80 0.04 mg/mL 1.60±2.40陽性藥組 200 ng/mL 100 0.454 5±0.204 6 40 ng/mL 100 8 ng/mL 92.80±2.40 1.6 ng/mL 83.20±4.16 0.32 ng/mL 61.60±5.23 0.064 ng/mL 23.60±4.21 0.458 5±0.371 6

3.3 太芪培元顆粒對HIV-1ⅢB感染C8166細胞p24表達的抑制作用

太芪培元顆粒對HIV-1復制表達p24抗原的抑制率隨藥物濃度的增加而升高，而對照藥AZT的趨勢與其相同，見表3。

表3 2組不同濃度HIV-1ⅢB感染C8166細胞后p24表達抑制作用比較（±s）

表3 2組不同濃度HIV-1ⅢB感染C8166細胞后p24表達抑制作用比較（±s）

組別 濃度 p24抗原抑制率/% EC50太芪培元顆粒組 5 mg/mL 100.44± 0.62 1 mg/mL 74.73±13.56 0.2 mg/mL 23.20±19.38 0.04 mg/mL 9.68±23.07 0.008 mg/mL 11.55±16.48 0.001 6 mg/mL -陽性藥組 200 μg/mL 100.32± 0.39（0.56±0.27）mg/mL 40 μg/mL 100.10± 0.22 80 μg/mL 98.62± 1.66 1.6 μg/mL 91.88± 3.18 0.32 μg/mL 7.70±14.12 0.064μ g/mL -1.92±15.95（0.43±0.29）ng/mL

3.4 太芪培元顆粒對HIV-1活性治療指數的影響

根據實驗數據及公式（治療指數＝CC50÷EC50），太芪培元顆粒合胞體抑制實驗治療指數為5.84～12.97，對照藥AZT治療指數為1 902 038～6 996 785；p24抑制實驗中，太芪培元顆粒治療指數為5.30～8.74，對照藥AZT治療指數為1 904 680～9 795 500。表明太芪培元顆粒體外抗HIV-1病毒活性較弱。

4 討論

太芪培元顆粒用于治療氣陰兩虛、肺腎不足型AIDS，以太子參、生地黃為君藥。太子參味甘、微苦，歸脾、肺經，功效為補氣健脾、生津潤肺；生地黃味甘、苦，性寒，歸心、肝、腎經，功效為清熱涼血、養陰生津。本方重用二藥，以達益氣養陰之功效。該藥在臨床應用中可改善患者癥狀體征，提高免疫力，但本研究體外抗HIV-1病毒結果顯示其抗HIV活性較弱。

近年來，中醫藥對AIDS的防治研究成果初顯，但其作用機制的研究依然是難點，尤其是中藥復方的作用機制研究。在藥物體外抗HIV病毒研究中，篩選了大量中藥及其有效成分均有體外抗病毒活性。大量臨床研究表明，中藥復方在AIDS治療的各個領域均有所長，例如對帶狀皰疹的中西醫結合治療，對高效抗逆轉錄病毒治療相關血脂異常的研究，對患者免疫重建的研究等，均取得較好的療效[8-11]。與此同時，研究者也指出，中醫藥治療的療效可能是通過改善患者免疫功能低下等機制起到緩解臨床癥狀的作用，但具體作用機制及如何確定中藥介入的指征和時機等問題需要深入研究[12]。

目前研究中可見小樣本觀察提出中藥治療不僅可以提高CD4+水平，同時還可以降低病毒載量[13]，但是缺乏大樣本規范研究的數據。有學者提出運用中醫免疫觀，從防治、養生的多方面入手，調整HIV/AIDS患者的免疫平衡，發揮中醫藥在診治過程中微觀調節與宏觀辨證相結合的優勢，通過進行相應的免疫調理達到提高免疫能力的治療目的[14]。

綜上，中醫藥防治AIDS要找準切入點，不可盲目以抗病毒為目標，偏離了中醫藥臨床療效的實際意義。

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Study on Vitro Anti-HIV-1 Activity of Taiqi Peiyuan Granules

MA Xiu-lan1, MA Jian-ping1,

ZHANG Ying1, ABUDUREYIMU Aihemaiti1, LI Jing-ru1, ZENG Lin1, ZHENG Yong-tang2, YANG Liu-meng2, MA Li-xue2(1. Traditional Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Medical University, AIDS Lab of National Clinical Research Base of Traditional Chinese Medicine, Urumqi 830000, China; 2. Laboratory of Molecular Immunopharmacology, Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223, China)

Objective To evaluate the vitro anti-HIV-1 activity of Taiqi Peiyuan Granules. Methods MTT was used to detect cytotoxicity of Taiqi Peiyuan Granules; cytopathy method was used to detect the inhibitory activity of Taiqi Peiyuan Granules on acute infection of HIV-1; HIV-1 p24 antigen ELISA detection was used to detect inhibitory activity of Taiqi Peiyuan Granules for virus replication of HIV-1 acute infection cells, and count the medical therapeutic indexes. Results CC50of Taiqi Peiyuan Granules in cytotoxicity test was 3.761±0.370 mg/mL; the EC50of inhibition syncytial test was 0.454 5±0.204 6 mg/mL; the therapeutic index was between 5.84 and 12.97; p24 of Taiqi Peiyuan Granules in inhibition experiments was 0.56±0.27 mg/mL, and the therapeutic index was between 5.30 and 8.74. Conclusion Anti-HIV-1 activity of Taiqi Peiyuan Granules is relatively weak.

Taiqi Peiyuan Granules; human immunodeficiency virus; vitro antiviral activity; immunologic mechanism

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.016

R285.5

A

1005-5304(2016)04-0061-03

2015-05-08；編輯：華強）

國家科技重大專項（2014ZX10005003）；新疆醫科大學科研創新基金項目（XJC201181）

馬建萍，E-mail：majianpingm@163.com