新疆阿魏乙酸乙酯部位質量控制方法研究

張海英，李偉，周龍龍，姜林，周銘心

1.新疆醫科大學附屬中醫醫院，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆醫科大學，新疆 烏魯木齊 830011

新疆阿魏乙酸乙酯部位質量控制方法研究

張海英1，李偉1，周龍龍2，姜林1，周銘心2

1.新疆醫科大學附屬中醫醫院，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆醫科大學，新疆 烏魯木齊 830011

目的 建立新疆阿魏乙酸乙酯部位質量控制方法。方法 采用高效液相色譜法測定新疆阿魏乙酸乙酯部位的阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C含量。色譜柱為Waters XTerra RPC18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸水為流動相，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長324 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。結果 阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C分別在0.05～1.0、0.132～2.64、0.118～2.36 mg/mL范圍內線性關系良好，平均回收率分別為99.34%、98.96%、99.24%。新疆阿魏乙酸乙酯部位的阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C含量分別為33.4、76.5、72.3 mg/g。結論 該方法操作簡單，結果準確，具有較好的重復性和穩定性，可為新疆阿魏乙酸乙酯部位的質量控制提供參考。

新疆阿魏；乙酸乙酯部位；阿魏酸；法尼斯淝醇A；法尼斯淝醇C；質量控制

阿魏屬隸屬于傘形科前胡族，約有150余種，主要分布于地中海、中亞及其鄰邊地區，我國約有26種1變種[1]，主要分布于新疆。2010年版《中華人民共和國藥典》收載的阿魏為傘形科植物新疆阿魏Ferula sinkiangensis K.M.She或阜康阿魏Ferula fukanensis K.M.Shen的樹脂，味苦、辛，溫，歸脾、胃經，具有消食、化癥、散痞、殺蟲功效[2]。近年來，由于發現其具有植物雌激素作用和抗癌活性而倍受關注。新疆少數民族用其治療胃腸道腫瘤。國外研究表明阿魏同屬植物有明確的抗腫瘤作用[3-4]。本課題前期研究結果表明，新疆阿魏乙酸乙酯部位對人結腸癌HCT116細胞有一定的抑制增殖和促進凋亡作用，表明新疆阿魏有抗腫瘤作用[5]。

本研究檢測的除阿魏酸外的特征成分法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C在阿魏屬的多個種如Ferula assafoetida、Ferula persica等均分離得到，且發現在抗癌方面具有很好的藥理活性。法尼斯淝醇A在劑量1 mg/kg能夠極大抑制小鼠肺癌細胞株移植的肺癌模型小鼠的癌細胞擴散面積，還能通過影響血管內皮生長因子受體（VEGFR）1和VEGFR2來抑制腫瘤的新生血管生成；能夠抑制巨噬細胞內一氧化氮合成和刺激脂多糖與干擾素-γ，從而治療一些神經性病變[6]。法尼斯淝醇C則對多耐耐藥腫瘤細胞有非常好的效果，能抑制耐藥腫瘤細胞胞內糖蛋白（p-gp）的運輸功能，阻止p-gp將胞內的抗腫瘤藥物排出胞外，在低濃度0.5 μg/mL就能有效抑制多藥耐藥腫瘤細胞株MCF7/ADR的p-gp的運輸功能[7]。可見，阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C可視為新疆阿魏發揮抗腫瘤作用的物質基礎。基于中藥多成分多靶點作用特點，本研究同時測定新疆阿魏乙酸乙酯部位中阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C含量，為進一步完善新疆阿魏乙酸乙酯部位的質量控制提供一定的參考依據。

1 儀器與試藥

AL 204電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；超聲波清洗機（200 W，40 kHz），昆山市超聲儀器有限公司；Direct-QTM5超純水儀，Millipore；微孔濾膜，上海半島實業有限公司凈化器材廠；無油真空泵，HP-01；高效液相色譜儀，Waters 2695，DAD檢測器。

阿魏藥材為傘形科植物新疆阿魏Ferula sinkiangensis K.M.Shen的樹脂，購于新疆伊犁，經新疆伊犁州食品藥品檢驗所檢驗合格，批號20120004。

阿魏酸對照品，中國食品藥品檢定研究院，批號110773-201012；法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C對照品，沈陽藥科大學制備，經UV、NMR、MS、IR鑒定，HPLC純度不低于98%。色譜乙腈（美國Fisher Scientific），水為超純水，磷酸、乙酸乙酯、石油醚等均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XTerra RPC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈為流動相A，0.1%磷酸水為流動相B，進行梯度洗脫（0～25 min，15%～30%A；25～35 min，30%A；35～55 min，45%A；55～85 min，50%A～60A%）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：324 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL[8-9]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C 5.02、13.22、11.84 mg于10 mL容量瓶，加甲醇超聲溶解后，定容，即得。2.2.2 供試品溶液的制備 取新疆阿魏400 g，用2000 mL石油醚（30～60 ℃）超聲提取40 min，控溫在40 ℃以下，提取2次，過濾，棄去石油醚，殘渣揮盡石油醚后，用乙酸乙酯2000 mL超聲提取2次，每次30 min，過濾，合并提取液，減壓濃縮，即得阿魏乙酸乙酯部位60.81 g。取阿魏乙酸乙酯部位0.20 g，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加適量甲醇，超聲提取20 min，再用甲醇定容，過0.45 μm微孔濾膜，作為供試品溶液。

2.3 系統適用性試驗

按上述色譜條件，分別精密吸取阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C對照品溶液及供試品溶液各10 μL，分別進樣。在100～400 nm范圍內，3種對照品及供試品的紫外-可見光譜均在324 nm處有最大吸收，由此確定檢測波長為324 nm。在所選擇的色譜條件下，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，有相同保留時間的色譜峰，且與其他成分分離度良好。色譜圖見圖1。

2.4 線性關系考察

阿魏酸對照品以甲醇為溶劑配制0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mg/mL的系列溶液，在上述色譜條件下分別進樣分析，在0.05～1.0 mg/mL范圍內，得線性方程Y＝4 084 578X＋10 468，r＝0.999 6。

法尼斯淝醇A對照品以甲醇為溶劑配制0.132、0.264、0.528、1.056、2.112、2.64 mg/mL的系列溶液，在上述色譜條件下分別進樣分析，在0.132～2.64 mg/mL范圍內，得線性方程Y＝19 876 178X＋490 60，r＝0.999 4。

法尼斯淝醇C對照品以甲醇為溶劑配制0.118、0.236、0.472、0.944、1.888、2.36 mg/mL的系列溶液，在上述色譜條件下分別進樣分析，在0.118～2.36 mg/mL范圍內，得線性方程Y＝21 292 276X－570 646，r＝0.999 5。

圖1 阿魏乙酸乙酯部位中阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C HPLC圖

2.5 精密度試驗

分別取法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C、阿魏酸對照品溶液，連續進樣5次，記錄色譜峰，計算3種對照品峰面積的RSD分別為1.24%、0.98%、1.12%，結果表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24、48 h檢測，記錄色譜峰，計算法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C、阿魏酸峰面積的RSD分別為1.56%、1.47%、1.23%，結果表明供試品溶液在48 h內穩定。

2.7 重復性試驗

取同一批次阿魏乙酸乙酯部位提取物，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，進行檢測，記錄色譜圖和峰面積，計算法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C、阿魏酸峰面積的RSD分別為1.79%、1.17%、1.58%，結果表明本方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取阿魏乙酸乙酯部位約0.1 g，精密稱定，置于50 mL錐形瓶中，制作6份，加入阿魏酸4.137 5 mg、法尼斯淝醇A 7.153 4 mg、法尼斯淝醇C 6.953 4 mg，加適量甲醇，超聲提取20 min，用甲醇定容，過0.45 μm微孔濾膜，按上述色譜條件進行檢測。測得阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C平均回收率分別為99.34%、98.96%、99.24%，RSD分別為1.83%、2.12%、1.35%，符合回收率要求，見表1。

表1 阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C加樣回收率試驗

2.9 樣品含量測定

精密稱取阿魏乙酸乙酯部位0.2 g，共3份，按供試品溶液制備方法制備，按上述色譜條件測定樣品含量，并取平均值。結果新疆阿魏乙酸乙酯部位中阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C含量分別為（33.4±0.3）、（76.5±1.4）、（72.3±0.6）mg/g。

3 討論

3.1 色譜峰光譜一致性檢測

應用二級管陣列檢測器和色譜工作站，對樣品中法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C、阿魏酸和對照品進行紫外-可見吸收光譜掃描，結果兩者紫外-可見吸收圖譜基本一致。

3.2 色譜條件的考察

本試驗比較了甲醇-水系統和乙腈-水系統，在使用甲醇-水系統時，雜質較多，難以達到滿意的分離效果，故選擇紫外吸收較小的乙腈-水系統。流動相中性的條件下，色譜峰分離度不好，嚴重拖尾，對0.05%、0.1%、0.15%不同濃度的磷酸溶液進行了考察，結果使用0.1%磷酸能很好地抑制峰拖尾，且相對穩定，所以流動相最終確定為乙腈-0.1%磷酸溶液[10]。

3.3 提取方法的選擇

本試驗對阿魏乙酸乙酯部位采用了回流提取與超聲提取，發現二者特征成分含量差異不大，但超聲提取簡單、易行，故采用超聲提取法。在對超聲提取溶劑進行篩選時，比較了甲醇-甲酸（95∶5）、乙醇及甲醇的差異，結果發現，甲醇提取的供試品溶液特征成分含量較高，因此采用甲醇為提取溶劑。對超聲提取時間也進行了篩選，超聲30 min后，特征成分含量趨于穩定，所以確定超聲時間為30 min。

3.4 含量測定結果的分析

在2010年版《中華人民共和國藥典》收載的傘形科植物新疆阿魏Ferula sinkiangensis的質量控制中，只有阿魏酸的薄層色譜鑒別，沒有成分的含量測定。本研究基于阿魏屬植物的特征成分阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C在阿魏屬的多個種如Ferula assafoetida、Ferula persica等均有分離得到，且在抗癌方面具有很好的藥理活性，委托沈陽藥科大學制備了法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C的單體化合物，經檢測，新疆阿魏乙酸乙酯部位法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C的含量均在6%～9%左右，含量較高，可作為新疆阿魏的主要特征有效成分及指標性成分，對新疆阿魏抗癌研究的物質基礎與質量控制以及新疆阿魏其他藥理藥效研究有著十分重要的意義。

對含多種有效成分的新疆阿魏乙酸乙酯部位來說，只測定單一或幾種成分，不足以全面反映內在質量。本試驗采用梯度洗脫的方法，同時測定3種有效成分的含量，所建立的方法操作簡便、重復性好，可用于新疆阿魏乙酸乙酯部位的質量評價，以保證其臨床用藥的有效性。

[1] 沈冠冕,新疆植物志：第三冊[M].烏魯木齊：新疆科學技術出版社, 2011：578-601.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫藥科技出版社,2010：176.

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Study on Quality Control of Ethyl-acetate Parts of Ferula Sinkiangensis

ZHANG Hai-ying1,

LI Wei1, ZHOU Long-long2, JIANG Lin1, ZHOU Ming-xin2(1. Affiliated TCM Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, China; 2. Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

Objective To establish the method for quality control of ethyl-acetate parts of Ferula sinkiangesis. Methods HPLC was used to detect the contents of ferulic acid, farnesiferol A and farnesiferol C. Waters XTerra RPC18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) was used; acetonitrile-0.1% phosphoric acid was as mobile phase with gradient elution; flow rate was 1.0 mL/min; detective wavelength was 324 nm; temperature was 30 ℃; sample volume was 10 μL Results Ferulic acid, farnesiferol A, and farnesiferol C showed a good linear relationship range from 0.05–1.0 mg/mL, 0.132–2.64 mg/mL, and 0.118–2.36 mg/mL, respectively. The average recovery rates were 99.34%, 98.96% and 99.24% respectively. The contents of ferulic acid, farnesiferol A and farnesiferol C were 33.4, 76.5, 72.3 mg/g respectively. Conclusion The method was simple, accurate and repeatable, with good repeatability and stability, which can be used for the quality control of ethyl-acetate parts of Ferula sinkiangesis.

Ferula sinkiangesis; ethyl-acetate part; ferulic acid; farnesiferol A; farnesiferol C; quality control

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.022

R284.1

A

1005-5304(2016)04-0083-04

2015-05-20）

（

2015-06-09；編輯：陳靜）

國家自然科學基金（81260625）

周銘心，E-mail：zmx9998@vip.sina.com