P選擇素為靶標的MRI在大鼠急性胰腺炎病情輕重分級中的應用

田冰 劉日 陳士躍 劉芳 賈國榮 李晶 陳錄廣 王莉 陸建平

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·論著·

P選擇素為靶標的MRI在大鼠急性胰腺炎病情輕重分級中的應用

田冰 劉日 陳士躍 劉芳 賈國榮 李晶 陳錄廣 王莉 陸建平

目的 探討P選擇素為靶標的磁共振靶向對比劑(P-Gd-probe)在大鼠急性胰腺炎(AP)病情輕重分級中的應用。方法 采用腹腔注射L-精氨酸溶液(100mg/100g體重)3次、間隔1h的方法制備SD大鼠AP模型，對照組注射等容積生理鹽水，依照病理結果將AP大鼠分為急性水腫性胰腺炎(AEP，造模后6、12h)組及急性壞死性胰腺炎(ANP，造模后24、48h)組。造模6、12、24、48h大鼠及對照組大鼠行磁共振T1加權橫斷位平掃及增強掃描，對比劑采用P-Gd-probe。測量增強前后胰腺部位的信號聲噪比(SNR)。掃描完成后取胰腺組織行病理學檢查，采用免疫組織化學方法檢測胰腺組織P選擇素表達。結果 造模6h后胰腺組織出現炎癥改變，且炎性程度隨造模時間延長而加重，胰腺組織P選擇素蛋白表達也隨AP的炎性程度加重而增高。對照組增強前后胰腺組織SNR值基本不變；AEP組增強前后SNR值分別為17.22±1.35、37.38±1.66，ANP組分別為16.29±1.39、58.18±1.03，這兩組增強后的SNR值均顯著高于增強前，差異均有統計學意義(t值分別為-49.59、-86.09，P值均<0.001)。結論MRI時選擇P選擇素為靶標的單克隆抗體靶向對比劑有助于對AP病情嚴重程度的判斷。

胰腺炎，急性壞死性；P選擇素； 靶向對比劑； 磁共振成像

Fund program: National Natural Science Foundation of China(81300366)

急性胰腺炎(AP)是胰酶消化自身及周圍組織所引起的炎癥反應。輕癥急性胰腺炎(MAP)具有自限性，但20%～30%可以發展成為重癥急性胰腺炎(SAP)，SAP病情兇險，預后較差。因此，及早診斷、分型和評估對掌握AP的進展、及時有效干預治療及判斷預后尤為重要。目前的臨床診斷及評分系統都存在一定的局限性，如何準確、客觀、簡易地判斷AP的病情輕重成為臨床亟待解決的關鍵問題。基于P選擇素在AP時表達增高，且在MAP與SAP中表達具有差異的特征[1]，本研究構建以P選擇素為靶標的單克隆抗體磁共振成像(MRI)靶向對比劑，并對AP大鼠行MRI，觀察P選擇素的表達，探討其在判斷AP病情嚴重程度中的應用價值。

材料與方法

一、大鼠AP模型制作

25只雄性SD大鼠，體重250～300 g，按數字表法隨機分為對照組及AP 6、12、24、48 h組，每組5只。實驗前大鼠禁食12 h，自由飲水。用生理鹽水配制濃度為20%的L-精氨酸溶液。以腹腔注射L-精氨酸溶液100 mg/100 g體重3次、間隔1 h的方法制備AP模型。對照組同法注射等容積生理鹽水。3次注射完成后，給予大鼠正常食物和水[2]。

二、P選擇素為靶標的磁共振對比劑(P-Gd-probe)的制備

精密稱取14 mg的磷脂材料DSPE-PEG-COOH和2 mg的Gd造影材料Gd-DTPA-SA，應用甲醇充分溶解后倒入燒瓶中進行旋轉蒸發1 h，加入1 ml蒸餾水超聲充分溶解剩余產物，通過納米級薄膜擠壓20次，形成載Gd-DTPA的MRI探針(Gd-probe)。向該探針溶液加入100 mg的P選擇素單克隆抗體以及50 μg的二氯乙烷，混合后透析除去游離分子，最終獲得P選擇素單克隆抗體修飾的MRI探針(P-Gd-probe)。

三、在體MRI掃描

MRI掃描采用Siemens 3.0T磁共振成像儀(Skyra, Siemens medical solution, Erlangen, Germany)。 AP組分別于造模后6、12、24、48 h時間點通過小動物氣麻機麻醉大鼠，固定于MRI手臂線圈中，采用T1加權快速自旋回波序列(T1weighted image Turbo Spin Echo, T1WI TSE)進行掃描，獲取T1WI的橫斷面圖像。成像參數：重復時間(TR) 460 ms，回波時間(TE) 12 ms，視野68 mm×80 mm，矩陣216×256，層厚1 mm，層間距0，回波鏈長度3，層數20，平均數6，掃描時間(TA)6∶40。T1WI平掃結束后經尾靜脈注射P-Gd-probe靶向對比劑(Gd劑量為0.1 mmol/kg體重)，注射完成后采用上述T1加權序列獲取增強后圖像。掃描結束后測量增強前后T1WI序列胰腺部位的信號聲噪比(signal noise ratio, SNR)。

四、胰腺組織病理學檢查及P選擇素表達檢測

MRI掃描結束后立即處死大鼠，迅速取出胰腺腺體以甲醛溶液固定，常規行組織病理學檢查，由病理科醫師盲法讀片，并參考Schmidi等[3]的方法從水腫、腺泡壞死、出血、脂肪壞死、炎癥及血管周圍浸潤等方面進行病理評分。同時采用免疫組織化學方法檢測胰腺組織P選擇素蛋白表達。

結 果

一、各組大鼠胰腺組織病理改變及P選擇素表達變化

對照組大鼠胰腺組織無明顯病理損傷(圖1A)；AP 6 、12 h組大鼠胰腺組織充血、間質水腫、少量炎癥細胞浸潤，少量散在的出血壞死灶，呈現急性水腫性胰腺炎(acute edematou pancveatitis, AEP，即MAP)改變(圖1B、1C)；24、48 h組大鼠胰腺組織結構破壞、大片出血壞死灶、大量炎細胞浸潤，呈現急性壞死性胰腺炎(acute necratizing pancreatitis, ANP，即SAP)改變(圖1D、1E)。依照病理檢測結果將大鼠分為對照組、AEP組及ANP組。免疫組織化學染色結果顯示，ANP組大鼠胰腺組織P選擇素蛋白高表達，AEP組大鼠胰腺組織低表達，對照組大鼠胰腺組織未見表達(圖1F、1G、1H、1I、1J)。

二、各組大鼠胰腺MRI圖像的SNR值

對照組大鼠MRI掃描增強前后胰腺組織的SNR值分別為17.16±0.68、18.18±0.56，差異無統計學意義(t=-2.72，P=0.06)；AEP組增強前后SNR值分別為17.22±1.35、37.38±1.66，ANP組分別為16.29±1.39、58.18±1.03，這兩組增強后的SNR值均顯著高于增強前，差異均有統計學意義(t值分別為-49.59、-86.09，P值均<0.001，圖2)，且ANP組的增加較AEP組更為顯著，差異有統計學意義(t=-5.94;P<0.001)。

圖1 對照組、AEP組、ANP組大鼠胰腺組織病理改變(1A、1B、1C、1D、1E，HE×200)及P選擇素蛋白表達(1F、1G、1H、1I、1J，免疫組織化學×200)

圖2 對照組、AEP組、ANP組磁共振增強前(2A、2B、2C)及增強后(2D、2E、2F)T1WI橫斷位圖

AP是指多種病因引起的胰酶激活，以胰腺局部炎癥反應為主要特征，伴或不伴有其他器官功能改變的疾病，臨床上包括MAP和SAP。SAP病情兇險，病死率高，病程中常伴發肝、腎等胰外器官的損害[4]。早期發現疾病重癥趨勢能夠指導臨床醫師在一定的時間窗內采取更積極的干預措施，從而減輕不良后果[5]。雖然臨床上有APACHEⅡ評分、Ranson評分、Balthazar CT分級[6]等多個客觀評估標準和反映胰腺病理形態學改變的影像學標準，但幾種評分系統的側重點及測評時間不同，單獨應用都不可避免存在片面性，因此需要一種簡單、方便的方法對AP進行早期診斷及預后判斷。

AP的發生、發展不完全取決于胰酶的消化，也與胰腺微循環障礙及炎癥遞質造成的多器官損害有關。研究表明胰腺血液循環障礙可以誘發AP和促使水腫性胰腺炎發展成為出血壞死性胰腺炎[7]。P選擇素存在于血小板α顆粒和血管內皮細胞Weibel-Palade小體，為具有特異性的血小板活化標志物，是血小板活化和釋放功能最直接、最敏感的指標。生理情況下P選擇素表達很低，在凝血酶、白三烯、TNF-α等炎癥因子及炎癥遞質的激活下，P選擇素迅速在活化的內皮細胞和血小板表面表達，其作用是促進細胞之間的連接，在調節紅細胞和內皮細胞的相互作用和血小板活化中起著重要的作用[8]。有研究結果[9]顯示，MAP患者血小板僅輕度活化，而SAP患者血小板處于高度活化狀態，血小板活化程度與AP患者病情輕重程度密切相關，提示監測血漿P選擇素含量有助于對AP患者病情輕重的判別。

MRI是一種完全無創的影像學診斷方法，在此基礎上，基于細胞與分子水平的MRI靶向成像已經成為分子影像學的研究熱點[10]。利用單克隆抗體進行活體成像是MRI的重要方法之一，單克隆型MRI對比劑是將單克隆抗體與MRI順磁性或超順磁性粒子結合，新形成的螯合物既具有靶向特異性又具有MRI對比劑的作用，其不僅能夠與某些器官、組織及病灶靶特異性結合，而且能夠增強其MRI信號強度，從而達到靶向診斷的目的。Gd-DTPA是一種順磁性T1WI陽性對比劑，具有親水性、分子量小的特點，注入血管后迅速向周圍組織間隙分布，由腎臟排泄，即使腎功能有損害，它也能經腎排除，是目前應用最廣泛的MRI對比劑。Gd-DTPA不具有組織或器官的選擇性，故如果要作為靶向的對比劑，即需要連接特異性的抗體。

本研究基于P選擇素在AP中表達增高且在MAP與SAP中表達具有差異的特點，構建以P選擇素為靶標的單克隆抗體磁共振靶向對比劑，并進行大鼠AP模型活體MRI觀察。研究結果表明，靶向對比劑P-Gd-probe增強前后對照組、AEP組及ANP組胰腺組織的SNR的變化具有顯著差異。因此，MRI時選用P選擇素為靶標的單克隆抗體磁共振靶向對比劑可區分AEP與ANP，有助于AP病情嚴重程度的判斷。

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(本文編輯：呂芳萍)

MRI molecular imaging targeting P selectin in severity grading of acute pancreatitis in rats

TianBing,LiuRi,ChenShiyue,LiuFang,JiaGuorong,LiJing,ChenLuguang,WangLi,LuJianping.

DepartmentofRadiology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LuJianping,Email:cjr.lujianping@vip.163.com

Objective To investigate the application of MRI targeting contrast agent (P-Gd-Probe) for P selectin in evaluating the severity grades of acute pancreatitis(AP). Methods L-arginine solution (100mg/100kg) were intraperitoneally injected for 3 times once an hour to establish AP model in SD rats. Control group was injected with normal saline in a equal volume. All rats were divided into acute edematous pancreatitis (AEP) group (6 h and 12 h after model establishment)and acute necrotizing pancreatitis (ANP) group (24 h and 48 h after model establishment) based on the pathology. The rats were examined by T1WI plain and enhanced scanning at 6 h, 12 h, 24 h and 48 h after injection, and P-Gd-probe was as the enhanced contrast agent. The signal noise ratio (SNR) of the pancreas were measured before and after enhancement. Then the pancreas tissues were harvested for pathological examination and P selectin expression in pancreatic tissue was detected using immunohistochemical analysis. Results Inflammation was observed in pancreatic tissue at 6h after establishment, and became more serious as the modeling time extended. P selectin expression was increased as pancreatitis inflammation became more serious. The SNR of control group was stable before and after enhancement. The SNR before and after enhancement was 17.22±1.35 and 37.38±1.66 in AEP group,and 16.29±1.39 and 58.18±1.03 in ANP group. The SNR after enhancement was higher than that before enhancement, and the differences were significantly different (t=-49.59 and -86.09,P<0.001). Conclusions Monoclonal antibody MRI contrast agent targeting P selectin is helpful in evaluating the severity of AP.

Pancreatitis, acute necrotizing; P-selection; Targeted contrast agent; Magnetic resonance imaging

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.06.008

200433 上海，第二軍醫大學附屬長海醫院影像醫學科(田冰、劉日、陳士躍、劉芳、李晶、陳錄廣、王莉、陸建平)，核醫學科(賈國榮)

陸建平，Email: cjr.lujianping@vip.163.com

國家自然科學基金(81300366)

2016-07-18)