沉默胰腺癌PANC1細胞DcR3表達對T淋巴細胞免疫調節功能的影響

吳世樂 郭亞民 趙順云 王皓 安永德 劉林勛

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沉默胰腺癌PANC1細胞DcR3表達對T淋巴細胞免疫調節功能的影響

吳世樂 郭亞民 趙順云 王皓 安永德 劉林勛

胰腺癌是常見消化道惡性腫瘤之一，起病隱匿、早期臨床癥狀不典型、診斷難度較高，加之其侵襲性較強、惡性程度較高，導致手術腫瘤切除、放療和(或)化療的療效不佳，患者預后較差[1-2]，病死率居各類惡性腫瘤第4位[3]，因此尋找早期診斷的特異性基因，對評估胰腺癌病情和提供分子靶向治療潛在“靶點”具有極其重要的意義。誘騙受體3(DcR3)屬于腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor, TNFR)超家族成員之一，在多種腫瘤組織過度表達，具有抑制細胞凋亡和促腫瘤細胞免疫逃逸的功能[4]，與腫瘤發生、發展具有密切相關性。本研究應用RNA干擾方法沉默胰腺癌PANC1細胞DcR3的表達，觀察DcR3基因沉默后T淋巴細胞功能的變化。

一、材料與方法

1．靶向DcR3表達載體的構建：依照GenBank內DcR3基因序列(No：NM_003823)設計、合成靶向DcR3基因的shRNA，通過BLAST數據庫分析該片段和其他分子無同源性，委托廣州市銳博生物科技有限公司合成。shRNA上游序列5′-GTCATCGACTITGAGTGAAGCCACAGATGTAGAAAGCC-ACAAAGTCGATGACG-3′，下游序列5′-7TACACGCAGTTCTG-GAACTACAGTGAAGCCACAGATGTAGTAGTTCCAGAACTGC-GTGTAG-3′，退火后構成雙鏈，插入線性化的含有綠色熒光蛋白(GFP)的載體PP-GFP(美國Abcam公司)，然后轉化感受態E.Coli TOPl0細胞，置于含壯觀霉素LB瓊脂糖培養基內培養16 h，提取小量質粒，經XhoI和EcoRI雙酶切及測序鑒定，重組質粒命名為PP-GFP-DcR3。

2．重組質粒轉染細胞：人胰腺癌細胞株PANC1購自武漢普諾賽生命科技有限公司，取對數期細胞接種于6孔培養板，每孔2×106個細胞，待細胞融合達50%～70%時，應用LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)將重組質粒PP-GFP-DcR3轉染PANC1細胞，常規培養48 h后于熒光顯微鏡下觀察轉染效率，同時設空質粒PP-GFP轉染組及未轉染質粒組。

3．細胞DcR3 mRNA表達檢測：取上述各組轉染48 h細胞，應用Trizol(Invitrogen公司)提取細胞總RNA，采用實時PCR法檢測細胞DcR3 mRNA表達。DcR3探針引物為5′-FAM-CTCCTCAGCTCCTGGTACCCT-TAMRA-3′，上游引物為5′-CTCTTCCTCCCATGACAC-3′，下游引物為5′-CTGGAAAGCCACAAAGTC-3′，擴增片段112 bp。以β-actin為內參。PCR擴增條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s、62℃ 1 min、60℃ 1 min，共40個循環，最后72℃ 10 min。通過儀器自帶軟件獲取Ct值，以公式2-ΔΔCt計算mRNA相對表達量。

4．細胞培養上清DcR3、IFN-γ、IL-4 含量檢測：取上述各組轉染細胞培養上清，應用ELISA法測定DcR3、IFN-γ、IL-4含量，試劑盒購自BD公司，按照試劑盒說明書操作，最后上酶標儀測定450 nm處吸光度(A450)值。

5．CD4+、CD8+T細胞檢測：抽取健康者外周血20 ml，滴入含肝素抗凝試管，淋巴分離液分離獲取淋巴細胞，應用抗CD3抗體包被培養淋巴細胞，置于含胎牛血清1 ml、植物血凝素(PHA)10 μg、青霉素500 U、鏈霉素500 μg的RPMI1640培養液4 ml內，常規培養6 h。調整淋巴細胞濃度為1×109/L，分別與上述3組細胞按照10∶1比例混合培養，DMEM培養基加入2.5 mg/L PHA、500 U/ml IL-2各5 ml，常規培養72 h。收集、重懸細胞，調整細胞密度為1.5×104個/ml，取300 μl細胞懸液加入試管，加300 μl 8%多聚甲醛，混合后避光反應20 min，PBS洗滌細胞，離心棄上清，加300 μl皂泰，10 μl異硫氰酸熒光素(FITC)標記的CD4單抗(CIM-F1TC，BD公司)或藻紅蛋白(PE)標記的CD8單抗(CD8-PE，BD公司)避光孵育15 min，加入500 μl PBS重懸細胞，上流式細胞儀檢測熒光細胞數。每個樣品檢測30 000個以上細胞，通過儀器自帶軟件計算CD4+、CD8+T細胞比例。

二、結果

1．各組細胞DcR3mRNA表達及培養上清DcR3 蛋白含量的變化：PP-GFP-DcR3轉染組、PP-GFP轉染組、未轉染組PANC1細胞DcR3mRNA相對表達量分別為0.24±0.03、1.08±0.05、1.03±0.06；培養上清DcR3 蛋白含量分別為(21.22±3.21)、(80.13±7.08)、(79.20±8.23)ng/L。PP-GFP-DcR3轉染組顯著低于PP-GFP轉染組和未轉染組，差異均有統計學意義(F值分別為54.321、60.182，P值均<0.05)，而PP-GFP轉染組與未轉染組的差異無統計學意義。

2．各組細胞培養上清IFN-γ、IL-4含量變化：PP-GFP-DcR3轉染組、PP-GFP轉染組、未轉染組PANC1細胞培養上清IFN-γ含量分別為(21.73±2.41)、(15.43±3.10)、(14.95±4.21)ng/L；IL-4含量分別為(3.01±0.57)、(5.22±0.83)、(5.09±0.91)ng/L。PP-GFP-DcR3轉染組IFN-γ含量顯著高于其他兩組，而IL-4含量顯著低于其他兩組，差異均有統計學意義(F值分別為40.128、37.432，P值均<0.05)。

3．各組CD4+T細胞和CD8+T細胞數量變化：PP-GFP-DcR3轉染組、PP-GFP轉染組、未轉染組刺激健康者淋巴細胞后，CD4+T細胞占比分別為(46.20±2.81)%、(28.60±2.52)%、(27.35±2.31)%，PP-GFP-DcR3轉染組顯著高于其他兩組，差異有統計學意義(F=35.231，P<0.05)；而其他CD8+T細胞的差異無統計學意義(F=4.623，P>0.05，圖1)。

圖1 PP-GFP-DcR3轉染組(1A、1D)、PP-GFP轉染組(1B、1E)、未轉染組(1C、1F)刺激健康者淋巴細胞后CD4+、CD8+T細胞的分布

討論 腫瘤的發生、發展和機體免疫功能狀態相關，免疫功抑制性功能障礙可顯著增加腫瘤的發生率[5]。機體免疫功能受到多種免疫監視調控，其中包括特異性和非特異性的細胞免疫機制或體液免疫機制，而以T淋巴細胞介導的細胞免疫機制作用最明顯[6]。在免疫抑制機制中[7]，CD4+T淋巴細胞釋放白介素，刺激B淋巴細胞增殖，激活機體免疫應答，抑制腫瘤細胞生長和轉移；CD8+T淋巴細胞作用于T細胞表面受體，阻斷其和腫瘤細胞結合，并釋放多種免疫抑制因子，造成機體對腫瘤細胞免疫性降低，故腫瘤患者細胞免疫功能紊亂主要表現為CD4+T淋巴細胞數量下降，CD8+T淋巴細胞數量上升，CD4/CD8比例倒置，因此，通過調節T淋巴細胞免疫機制可能是胰腺癌基因治療的關鍵措施之一。

文獻報道[8]，腫瘤壞死因子(TNF)家族與其受體(TNFR)相互作用可對腫瘤細胞凋亡進行正調節或負調節，從而殺傷細胞。DcR3基因作為TNFR超家族成員之一，定位于人染色體20q213，由271個氨基酸殘基組成，總長1 114bp，屬于一種無跨膜區的可溶性蛋白。該基因具有抑制細胞凋亡和促進細胞免疫逃逸雙重調節功能，并可導致CD80、CD40和CD54等信號分子表達下調，降低T淋巴細胞活性和阻斷其活化功能。本研究結果顯示，胰腺癌PANC1細胞DcR3基因表達沉默后再與T淋巴細胞混合培養，結果CD4+T細胞數量顯著增多，CD8+T細胞數量無顯著變化，與Zhu等[9]的研究結果一致，表明DcR3基因沉默可抑制細胞免疫功能，促使癌細胞生長和轉移。

輔助性T細胞1(Thl)和Th2細胞作為重要的免疫調節細胞，前者能夠釋放IFN-γ等細胞因子，激活體液免疫攻擊腫瘤細胞，而后者釋放IL-4，使腫瘤細胞逃逸免疫監視和攻擊，在宿主體內長期存活。有研究報道[10]，將DcR3基因轉染大鼠，CD4+T細胞數量下降，并可抑制Th1細胞釋放IFN-γ和促使Th2細胞釋放IL-2。本研究結果顯示，沉默DcR3基因表達后細胞培養上清IFN-γ含量顯著增加，而IL-4含量顯著下降，與本課題組以往應用其他方法研究得到的結果一致[11]，由此可見，糾正失衡的Thl/Th2細胞因子網絡有利于恢復和發揮細胞免疫功能。

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(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.06.014

青海省人民醫院院內課題(2014)

810001 西寧，青海省人民醫院普外科

郭亞民，Email: 1159135996@qq.com

2016-05-05)