生物信息學分析mircoRNA在乳腺癌中的調控網絡

周嘉彬，呂鈺冰，韓澤平，何金花，黎毓光，朱劍霞

?

生物信息學分析mircoRNA在乳腺癌中的調控網絡

周嘉彬，呂鈺冰，韓澤平，何金花，黎毓光，朱劍霞

生物信息學是指綜合應用信息科學、數學的理論、方法和技術來管理、分析和利用生物分子數據的一門科學。科學地利用生物分子數據及其分析結果，可以大大提高研究和開發的科學性及效率[1]。miRNA（mircoRNA）是一類由內源基因編碼的長度為 20 ~ 24 個核苷酸的非編碼單鏈小分子 RNA。miRNA 能夠與靶信使 RNAs（mRNAs）3'-端非翻譯區（3'-UTR）互補配對，阻礙 mRNA 翻譯或使其穩定性降低而被降解，從而參與到轉錄后調控[2]。近年許多研究表明，miRNA 在腫瘤的發生發展中起著重要的作用[3-4]。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，是發達國家中引起女性死亡的第二大癌癥（在發展中國家位居第一）[5]。已有大量文獻報道，多種 miRNAs 在乳腺癌的發生、發展及腫瘤的治療過程中發揮著重要的作用[6-8]。因此，探討 miRNA 在乳腺癌細胞中的分子調控機制，能夠為抗癌策略提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

目前生物學信息軟件分為單機分析軟件、在線分析軟件和生物學數據庫，利用生物信息學軟件能夠提示、指導、替代實驗操作，利用對實驗數據的分析所得的結論設計下一階段的實驗，本次論文所用到的生物學信息軟件如下：

①人類 miRNA 疾病數據庫（HMDD v2.0，http://www. cuilab.cn/hmdd）

②miRwalk 2.0（http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/ zmf/mirwalk2/）

③PubMed（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）

④lncRNA 疾病數據庫（http://www.cuilab.cn/ lncrnadisease）

⑤starBase v2.0（http://starbase.sysu.edu.cn/）

⑥TransmiR（http://www.cuilab.cn/transmir）

⑦Cytoscape 軟件

1.2 方法

1.2.1 通過 HMDD v2.0 查詢已證實與乳腺癌相關的 miRNAs，并將所有 miRNAs 進行匯總，篩選出有 14 篇或以上文獻報道與乳腺癌相關的 miRNAs 作為研究對象。

1.2.2 運用 miRwalk 2.0 在線軟件對上述 miRNAs 進行分析研究，篩選出各個 miRNAs 的共同的靶基因。

1.2.3 運用 PubMed 搜索上述靶基因與乳腺癌之間關系的論文，并篩選出與乳腺癌密切相關的 miRNA 的靶基因。

1.2.4 通過 lncRNA 疾病數據庫查詢與乳腺癌相關的 lncRNAs（long noncoding RNAs），并運用 starBase v2.0 對所得到的 miRNAs 和 lncRNAs 進行綜合分析，得到與上述 miRNAs 相互作用的且與乳腺癌相關的 lncRNAs。

1.2.5 運用 TransmiR 在線軟件查詢上述 miRNAs 的轉錄因子并進行分析研究，篩選出 miRNAs 共同的轉錄因子，并通過 PubMed 查詢所得轉錄因子與乳腺癌的關系，篩選出與乳腺癌相關的轉錄因子。

1.2.6 運用 Cytoscape 軟件繪制出 miRNA 在乳腺癌中的分子調控網絡。

2 結果

2.1 與乳腺癌相關的 miRNAs

通過 HMDD v2.0 查詢已證實與乳腺癌相關的 miRNAs共 243 個，其中有 14 篇或以上文獻報道的 miRNA 有 hsa-mir-155、hsa-mir-200b、hsa-mir-200c 和 hsa-mir-21。其中 hsa-mir-155、hsa-mir-21 在乳腺癌的發生、發展過程中起到促進作用[9-10]，而 hsa-mir-200b、hsa-mir-200c[11-12]起到抑制作用（表 1）。

表 1 HMDD v2.0 數據庫中與乳腺癌相關的 miRNAs

2.2 與乳腺癌密切相關的 miRNA 的靶基因

運用 miRwalk 2.0 分析上述 4 個 miRNAs 的靶基因，其中 hsa-mir-155 共有 932 個靶基因，hsa-mir-200b 共有 202 個靶基因，hsa-mir-200c 共有 212 個靶基因，hsa-mir-21 共有 634 個靶基因。通過分析發現 SP1（Sp1 transcription factors）、SUZ12（suppressor of zeste 12 homolog）和 KLHL42（kelch like family member 42）為 hsa-mir-155、hsa-mir-200b、hsa-mir-200c 和 hsa-mir-21 共同的靶基因。通過 PubMed 查詢上述三個靶基因與乳腺癌的關系，發現當 SP1[13-15]和SUZ12[16-18]表達缺失時可抑制乳腺癌的生長（表 2），然而未找到 KLHL42 與乳腺癌的相關報道。

表 2 與乳腺癌密切相關的 miRNA 的靶基因

注：*表達缺失時可抑制乳腺癌生長。

2.3 與 miRNA 相互作用的乳腺癌相關的 lncRNA

通過 lncRNA 疾病數據庫查詢與乳腺癌相關的 lncRNAs 有 17 個，運用 starBase v2.0 對所得到的 miRNAs 和 lncRNAs 進行綜合分析，發現 lncRNA XIST（X inactive-specific transcript）與 hsa-mir-155、hsa-mir-200b、hsa-mir-200c 和hsa-mir-21 相互作用（圖1）。其中XIST 在乳腺癌的發生、發展過程中起到促進作用[19]。

圖 1 與 miRNA 相互作用的乳腺癌相關的 lncRNA

2.4 與乳腺癌密切相關的 miRNA 轉錄因子

運用 TransmiR 查詢上述 miRNAs 的轉錄因子，其中 hsa-mir-155 有 16 個轉錄因子，hsa-mir-200b 有 13 個轉錄因子，hsa-mir-200c 有 14 個轉錄因子，hsa-mir-21 有 16 個轉錄因子。然而只有 TGFB1（transforming growth factor beta 1）是 hsa-mir-155、hsa-mir-200b、hsa-mir-200c 和 hsa-mir-21 唯一共同轉錄因子（圖 2）。通過 PubMed 查詢發現，TGFB1 在乳腺癌的發生、發展過程中起到促進作用[20-21]。

2.5 運用 Cytoscape 軟件繪制出 miRNA 在乳腺癌中的分子調控網絡

從上述結果可知，hsa-mir-155、hsa-mir-200b、hsa-mir-200c 和 hsa-mir-21 這四個 miRNAs 可與其下游靶基因 KLHL42、SP1 和 SUZ12 的 mRNA 的 3'-UTR 配對結合，在轉錄水平調控其表達。其中 SP1 和SUZ12 與乳腺癌的密切相關。而進一步的分析發現，hsa-mir-155、hsa-mir-200b、hsa-mir-200c 和 hsa-mir-21 亦受其上游的轉錄因子 TGFB1 調控，并且能夠與 lncRNA XIST 相互作用，在乳腺癌發生發展中起著重要作用。如此所有的相關基因構成了一個 miRNA 在乳腺癌中的分子調控網絡（圖 3）。

圖 2 與乳腺癌密切相關的 miRNA 的轉錄因子

3 討論

miRNA 是一類進化上保守的，具有強大調控作用，與高等植物、動物的生長發育調節密切相關的單鏈非編碼小 RNA。Lee 等[22]在線蟲發育時鑒定了第一個 miRNA lin-4，隨后許多生物學家開始重新思考細胞遺傳調控方面的重要問題。由于 miRNA 序列、結構、豐度和表達方式具有多樣性，使其有成為 mRNA 編碼蛋白質強有力調節子的可能，因此 miRNA 的出現豐富了人們對蛋白質合成調控的認識。隨著 miRNA 分析技術的不斷成熟，許多 miRNAs的作用已被人所了解。目前認為 miRNA 是通過蛋白翻譯水平的調控影響基因的表達，從而參與到造血、發育、病毒防御、器官形成、細胞增殖和凋亡等調節途徑中。許多研究表明，miRNA 在糖尿病[23]、心血管疾病[24]、腫瘤[25]等眾多疾病中發揮著重要的作用。目前的研究主要致力于探索miRNA 在腫瘤治療中的作用[26]，以及如何通過抑制或促進 miRNAs 的表達來控制腫瘤細胞的增殖[27]。

乳腺癌的發生是一個多因素參與的多階段性過程，該病的具體病因及發病機制目前仍未明確。筆者通過 HMDD v2.0 查詢發現該網站到 2014 年 6 月份為止一共收錄了與乳腺癌相關的 miRNAs 243 個，探討 miRNAs 與乳腺癌關系的論文一共有 319 篇。其中各種 miRNAs 在乳腺癌中的作用機制各有所異，并通過各種途徑促進或抑制乳腺癌的發展。基于較多人認可的乳腺癌相關的 miRNA 的基礎上，本文利用生物信息學分析技術進行綜合分析，得出了一條與乳腺癌相關的分子調控網絡，但該分子調控網絡的可信度仍有賴于日后實驗驗證。在該網絡中 SP1 和 SUZ12 在接受上游信號后是如何促進或抑制乳腺癌細胞增殖和轉移的，具體的分子調控機制有待日后實驗解決。

此乳腺癌的分子調控網絡中，hsa-mir-155 和 hsa-mir-21可通過抑制下游基因的表達從而促進乳腺癌細胞增殖和提高乳腺癌細胞的侵襲能力[9-10]，但未有文獻報道在乳腺癌中 hsa-mir-155 和 hsa-mir-21 是如何調控 SP1 和 SUZ12 基因的表達。研究表明，hsa-mir-200b 和 hsa-mir-200c 可作用于 SP1 和 SUZ12 mRNA 的3'-UTR 從而抑制 SP1 和 SUZ12 的表達，SP1 和 SUZ12 的表達降低可抑制乳腺癌細胞增殖并誘導乳腺癌細胞凋亡[13, 17]。TGFB1 表達增高可提高乳腺癌細胞的侵襲能力，促進乳腺癌細胞轉移，降低乳腺癌患者的 5 年生存率[21]。Neilsen 等[28]發現在 p53 變異的乳腺癌細胞中，鋅指蛋白652 可直接抑制 hsa-mir-155 的轉錄因子 TGFB1、TGFB2 等的表達，從而降低乳腺癌細胞的侵襲與轉移能力。Yu 等[29]的研究中發現，在乳腺癌細胞中 TGFB1 可誘導 hsa-mir-21 與 MSH2（mutS homolog 2）結合而抑制其表達，從而促進乳腺癌細胞轉移。Xu 等[30]將乳腺癌細胞與間質干細胞混合培養，發現 TGFB1 可作用于 hsa-mir-200b 和 hsa-mir-200c 從而促進乳腺癌細胞上皮間質轉換。XIST 是乳腺癌治療預后的生物標志，當 XIST 高表達時乳腺癌的化療效果差，同時影響乳腺癌患者的生存率[19]。然而 XIST 與 miRNA 相互作用的機制有待日后實驗探討。

我們不難發現，當 TGFB1、XIST、hsa-mir-155、hsa-mir-21、SP1 和 SUZ12 表達活躍時能促進乳腺癌的發生，而 hsa-mir-200b 和 hsa-mir-200c 表達活躍時能抑制乳腺癌的發生。因此，在今后的工作中如何利用藥物提高 hsa-mir-200b 和 hsa-mir-200c 的表達，以及降低 TGFB1、XIST、hsa-mir-155、hsa-mir-21、SP1 和 SUZ12 的表達可能成為以后治療乳腺癌的重要研究方向。

綜上所述，生物學信息分析技術是我們探討 miRNA通過何種途徑在乳腺癌的發生、發展中起調控作用必不可少的技術。生物學信息分析和實驗論證相結合能使我們更高效地研究乳腺癌的發病機制，為實現靶基因治療提供更多的依據和可能。

[1] Ahmed A. Analysis of metagenomics next generation sequence data for fungal ITS barcoding: do you need advance bioinformatics experience? Front Microbiol, 2016, 7:1061.

[2] Monroig PD, Calin GA. MicroRNA and epigenetics: diagnostic and therapeutic opportunities. Curr Pathobiol Rep, 2013, 1(1):43-52.

[3] Zhao L, Zheng XY. MicroRNA-490 inhibits tumorigenesis and progression in breast cancer. Onco Targets Ther, 2016, 9:4505-4516.

[4] Xu H, Zhu J, Hu C, et al. Inhibition of microRNA-181a may suppress proliferation and invasion and promote apoptosis of cervical cancer cells through the PTEN/Akt/FOXO1 pathway. J Physiol Biochem, 2016. [Epub ahead of print]

[5] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012. CA Cancer J Clin, 2015, 65(2):87-108.

[6] Zhao L, Zheng XY. MicroRNA-490 inhibits tumorigenesis and progression in breast cancer. Onco Targets Ther, 2016, 9:4505-4516.

[7] Muhammad N, Bhattacharya S, Steele R, et al. Anti-miR-203 suppresses ER-positive breast cancer growth and stemness by targeting SOCS3. Oncotarget, 2016. [Epub ahead of print]

[8] Cabello P, Pineda B, Tormo E, et al. The antitumor effect of metformin is mediated by miR-26a in breast cancer. Int J Mol Sci, 2016, 17(8):pii: E1298.

[9] Tiago DM, Concei??o N, Caiado H, et al. Matrix Gla protein repression by miR-155 promotes oncogenic signals in breast cancer MCF-7 cells. FEBS Lett, 2016, 590(8):1234-1241.

[10] Kuang Y, Nie YJ. Exploration of the regulatory effect of miR-21 on breast cancer cell line proliferation and invasion as well as the downstream target genes. Asian Pac J Trop Med, 2016, 9(5):470-473.

[11] Feng ZM, Qiu J, Chen XW, et al. Essential role of miR-200c in regulating self-renewal of breast cancer stem cells and their counterparts of mammary epithelium. BMC Cancer, 2015, 15:645.

[12] Hong H, Yu H, Yuan J, et al. MicroRNA-200b impacts breast cancer cell migration and invasion by regulating Ezrin-Radixin-Moesin. Med Sci Monit, 2016, 22:1946-1952.

[13] Yao Y, Hu J, Shen Z, et al. MiR-200b expression in breast cancer: a prognostic marker and act on cell proliferation and apoptosis by targeting Sp1. J Cell Mol Med, 2015, 19(4):760-769.

[14] Zhang L, Yang W, Zhu X, et al. p53 inhibits the expression of p125 and the methylation of POLD1 gene promoter by downregulating the Sp1-induced DNMT1 activities in breast cancer. Onco Targets Ther, 2016, 9:1351-1360.

[15] Li L, Gao P, Li Y, et al. Erratum to: JMJD2A-dependent silencing of Sp1 in advanced breast cancer promotes metastasis by downregulation of DIRAS3. Breast Cancer Res Treat, 2016, 156(1):207-208.

[16] Peng F, Jiang J, Yu Y, et al. Direct targeting of SUZ12/ROCK2 by miR-200b/c inhibits cholangiocarcinoma tumourigenesis and metastasis. Br J Cancer, 2013, 109(12):3092-3104.

[17] Iliopoulos D, Lindahl-Allen M, Polytarchou C, et al. Loss of miR-200 inhibition of Suz12 leads to polycomb-mediated repression required for the formation and maintenance of cancer stem cells. Mol Cell, 2010, 39(5):761-772.

[18] Holm K, Hegardt C, Staaf J, et al. Molecular subtypes of breast cancer are associated with characteristic DNA methylation patterns. Breast Cancer Res, 2010, 12(3):R36.

[19] Schouten PC, Vollebergh MA, Opdam M, et al. High XIST and low 53BP1 expression predict poor outcome after high-dose alkylating chemotherapy in patients with a BRCA1-like breast cancer. Mol Cancer Ther, 2016, 15(1):190-198.

[20] Miret N, Pontillo C, Ventura C, et al. Hexachlorobenzene modulates the crosstalk between the aryl hydrocarbon receptor and transforming growth factor-β1 signaling, enhancing human breast cancer cell migration and invasion. Toxicology, 2016, 366-367:20-31.

[21] Ding MJ, Su KE, Cui GZ, et al. Association between transforming growth factor-β1 expression and the clinical features of triple negative breast cancer. Oncol Lett, 2016, 11(6):4040-4044.

[22] Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell, 1993, 75(5):843-854.

[23] Estrella S, Garcia-Diaz DF, Codner E, et al. Expression of miR-22 and miR-150 in type 1 diabetes mellitus: Possible relationship with autoimmunity and clinical characteristics. Med Clin (Barc), 2016, 147(6):245-247.

[24] Wu XC, Jia YP. Research progress of miR-126 in cardiovascular diseases. Chin J Clinicians (Electron Ed), 2016, 10(12):1800-1803. (in Chinese)

吳雪純, 賈永平. miR-126在心血管疾病中的研究進展. 中華臨床醫師雜志(電子版), 2016, 10(12):1800-1803.

[25] Pang C, Liu M, Fang W, et al. MiR-139-5p is increased in the peripheral blood of patients with prostate cancer. Cell Physiol Biochem, 2016, 39(3):1111-1117.

[26] Zhang X, Guo Q, Chen J, et al. Quercetin enhances cisplatin sensitivity of human osteosarcoma cells by modulating microRNA-217-KRAS axis. Mol Cells, 2015, 38(7):638-642.

[27] He D, Wang J, Zhang C, et al. Down-regulation of miR-675-5p contributes to tumor progression and development by targeting pro-tumorigenic GPR55 in non-small cell lung cancer. Mol Cancer, 2015, 14:73.

[28] Neilsen PM, Noll JE, Mattiske S, et al. Mutant p53 drives invasion in breast tumors through up-regulation of miR-155. Oncogene, 2013, 32(24): 2992-3000.

[29] Yu Y, Wang Y, Ren X, et al. Context-dependent bidirectional regulation of the MutS homolog 2 by transforming growth factor β contributes to chemoresistance in breast cancer cells. Mol Cancer Res, 2010, 8(12):1633-1642.

[30] Xu Q, Wang L, Li H, et al. Mesenchymal stem cells play a potential role in regulating the establishment and maintenance of epithelial-mesenchymal transition in MCF7 human breast cancer cells by paracrine and induced autocrine TGF-β. Int J Oncol, 2012, 41(3): 959-968.

廣州市番禺區中心醫院青年基金（2014-Q-03、2014-Q-05）；廣東省建設中醫藥強省項目（20141230）；廣州市番禺區科技和信息化局項目（2014-Z03-65）

511400 廣東省廣州市番禺區中心醫院檢驗科

韓澤平，Email：hanzeping1987@126.com

2016-09-12

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2016.06.014