自發性糖尿病模型KKAy小鼠海馬的形態學改變及中藥益氣養陰散結復方對其影響

田文楊，龍泓竹，吳淑馨，孫宏峰，白 穎，楊曉暉

(北京中醫藥大學東方醫院，北京 100078)

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自發性糖尿病模型KKAy小鼠海馬的形態學改變及中藥益氣養陰散結復方對其影響

田文楊，龍泓竹，吳淑馨，孫宏峰，白 穎，楊曉暉*

(北京中醫藥大學東方醫院，北京 100078)

目的 觀察自發性糖尿病模型KKAy小鼠海馬的形態學改變及中藥復方對其的影響。方法 選取雄性11～12周齡KKAy小鼠，將其隨機分為模型組及中藥組，同周齡雄性C57BL/6J小鼠為正常組。中藥組灌服中藥復方，模型組及正常組灌服等量蒸餾水，分別于實驗的第4、8、12周末處死各組小鼠，通過光鏡觀察海馬組織HE染色、計數海馬CA1區神經元細胞數量。結果 第4、8、12周模型組與中藥組海馬CA1區海馬神經元細胞數量與正常組相比，具有統計學意義(P<0.05)。第8周末，海馬CA1區神經元形態學發生變化，海馬神經元數量減少。第12周末，模型組小鼠神經元細胞出現明顯的形態異常，海馬細胞排列紊亂，CA1區、齒狀回部的多數神經元胞體、胞核出現顯著病理性改變，海馬神經元數量明顯減少。中藥治療組海馬組織的神經元細胞排列較整齊，第4、8周末僅見少量神經元細胞深染，第12周末部分神經元細胞發生形態學改變，明顯輕于模型組，海馬神經元細胞數量與模型組相比有統計學意義(P<0.05)。結論 18～20周齡的KKAy小鼠的海馬組織開始出現較明顯的神經元細胞損傷及減少的形態學改變，22～24周齡時，這種改變更為顯著。該中藥復方可有效的調節KKAy的糖脂代謝紊亂，干預和延緩KKAy小鼠海馬組織的病理學改變。

糖尿病腦病；海馬組織；中藥復方；KKAy小鼠

目前，糖尿病發病率逐年升高[1]，其慢性并發癥給患者帶來的影響逐漸顯現[2-3]。糖尿病腦病作為糖尿病主要的并發癥之一，受到了越來越廣泛的關注。糖尿病腦病主以認知功能下降為主要臨床特點，研究發現，隨著病程的延長，與認知功能相關的海馬區神經元細胞凋亡，繼而出現認知下降[4-6]。本研究采用自發性2型糖尿病KKAy小鼠為模型，觀察不同時期KKAy小鼠海馬組織神經元細胞的改變，探討KKAy小鼠出現糖尿病腦病的進程，并觀察中藥復方對KKAy小鼠血糖、血脂的影響,以及對KKAy小鼠海馬組織病理學改變的作用，探討對糖尿病腦病的干預作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 均購自于中國醫學科學院醫學實驗動物研究所：雄性SPF級C57BL/6J小鼠(許可證號：SCXK京2009-0007),10～12 周齡，18只；雄性SPF級KKAy小鼠(許可證號：SCXK京2009-0004),11～12周齡，36只。實驗期間，KKAy小鼠喂養高脂飼料(含量配比為10%豬油、10%蛋黃粉和10%葡萄糖)；C57BL/6J小鼠喂養普通小鼠生長維持顆粒飼料，均自由飲水。將小鼠適應性喂養1周后，斷尾取血測定空腹血糖，2次空腹血糖均在13.9 mmol/L以上則確定為糖尿病小鼠，納入實驗。實驗動物的飼養過程均在東直門醫院動物中心完成。

1.2 分組及給藥 小鼠適應性飼養1周后，隨機分組，C57BL/6J小鼠作為正常組，將18只C57BL/6J小鼠隨機分為4、8、12周組，各6只。KKAy小鼠隨機分為模型組和中藥組，各18只。模型組和中藥組再分別隨機分為3個小組，即4、8、12周組，各6只。實驗所用中藥復方由北京中醫藥大學東方醫院中藥房提供。小鼠等效劑量的給藥量為臨床成人每公斤體質量用藥量的10倍。中藥組予7.7g/(kg·d)灌服中藥益氣養陰散結復方，模型組及正常組予灌胃同體積的蒸餾水，分別灌胃4、8、12 周。

1.3 試劑與儀器 10%水合氯醛10 g，用雙蒸水稀釋至100 mL。穩豪型血糖儀及原廠試紙：美國強生公司。低溫高速離心機：Heraeus sepatech biofuge 28RS。隔水式恒溫培養箱(國產)：GNP-9080型。

1.4 標本采集及處理 在給藥后第 4、8、12周末處死動物稱取小鼠體質量后，用10%水合氯醛按0.4 mg/100 g的劑量進行腹腔注射，小鼠成功麻醉，腹主動脈采血，12 000 r/min，離心15 min，靜置備用待測血糖、血脂，剪開顱骨，將整個大腦完整移至4%多聚甲醛中浸泡等待包埋,待做HE染色。

1.5 檢測指標及方法 1)記錄小鼠一般情況、小鼠活動狀態、毛色、精神狀態、飲食、二便等，每周測體質量1次。2)血糖、血脂：處死前取血檢測血糖、血脂。3)大腦組織HE染色觀察海馬組織形態學改變。4)海馬CA1區神經元細胞計數：400倍顯微鏡下，隨機選取海馬CA1區不重疊的3個視野，計數正常的細胞數量，取其平均值，每個標本取3張連續切片，取其平均值。對結果進行統計學分析處理。

2 結果

2.1 各組小鼠的一般情況 正常組C57BL /6J進食飲水正常，毛色亮澤，精神狀態良好，反應靈敏，對抓取抵抗明顯；模型組KKAy小鼠形體肥胖，體質量增長迅速，逐漸出現毛色干枯無光澤，活動遲緩，反應遲鈍。中藥組干預治療8周后小鼠一般狀況較模型組具有不同程度改善。

2.2 各組小鼠血糖測定情況 見表1。

mmol/L

注:與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01;與模型組比較，△P<0.05

2.3 各組小鼠TG、TC測定情況 見表2,表3。

mmol/L

注:與正常組比較，##P<0.01;與模型組比較，△P<0.05

mmol/L

注:與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，△P<0.05

2.4 各組小鼠腦組織HE染色情況 光鏡下觀察各組小鼠海馬組織HE染色，正常組小鼠在第4、8、12周末均可見海馬CA1區、齒狀回部(DE區)神經元細胞排列整齊，結構清晰，細胞圓，胞漿淡染，胞質清晰可見，核仁清楚。模型組小鼠在第4周末時，海馬CA1區神經元細胞排列較整齊，與第4周末的正常組小鼠相比，可見少許散在的神經元細胞深染。模型組小鼠在第8周末時，海馬CA1區神經元細胞排列松散，形態發生變化，部分神經元細胞出現較明顯的細胞核固縮、細胞質減少。在12周末，模型組小鼠神經元細胞出現了非常明顯的形態異常，海馬細胞層次差，排列紊亂，數目減少，CA1區、齒狀回部的多數神經元胞體深染、皺縮，胞核變小、固縮濃染或胞核消失，細胞變細、變長。中藥治療組海馬神經元細胞排列較整齊，在第4、8周末僅可見少量神經元細胞深染，未見明顯形態學改變，雖然在第12周末部分神經元細胞發生了形態學改變，但與模型組相比，程度明顯輕于模型組。

2.5 各組小鼠腦組織海馬區計數 見表4。

個

注:與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，△P<0.05

3 小結

本實驗結果顯示，與正常小鼠相比，在第4、8、12周末，模型組小鼠的血糖和血脂水平均明顯高于正常組,但在第4周末，即14～16周齡的模型組KKAy小鼠海馬組織的形態學并沒有發生明顯變化,提示此時KKAy小鼠尚未出現明顯的神經元細胞損傷。從第8周末后，模型組小鼠海馬組織存在了較明顯的改變，神經元數目減少明顯，說明18～20周齡的KKAy小鼠已經開始出現了神經元損傷，但其臨床表現并不明顯。到了第12周末，長期處于高血糖、高血脂的狀態使模型組KKAy小鼠海馬組織CA1區、DE區神經元細胞的胞體、胞核等出現顯著的病理學改變，神經元數目減少較多，與此同時模型組小鼠反應遲鈍，活動遲緩，對抓取抵抗不明顯，提示22～24周齡KKAy小鼠存在明顯神經元損傷，出現了糖尿病腦病的改變[7-11]。

本實驗所用中藥復方具有益氣養陰，通絡散結的功效，以往研究[12]發現該復方可通過干擾腎素血管緊張素系統(RAS)激活，減少AngII蛋白過度表達，抑制心肌重構從而保護心肌功能，延緩糖尿病心肌病的進程；本中藥復方補氣陰以充髓海的同時，化痰活血通絡以除腦竅之結，早期干預以延緩糖尿病腦病發展。實驗發現通過中藥復方干預，中藥組KKAy小鼠海馬形態學較模型組有較明顯的改善，中藥組小鼠在第4、8周末僅可見少量神經元細胞深染,未見明顯的神經元細胞形態學改變，直至第12周末才出現部分神經元細胞發生了形態學改變，提示通過該中藥復方的干預，有效的延緩和阻止了糖尿病腦病的發生進程。本實驗發現，中藥復方可有效改善自發性KKAy糖尿病小鼠的糖脂代謝紊亂,這可能對預防和干預糖尿病小鼠海馬組織形態學改變有著重要意義。

綜上所述，KKAy小鼠作為自發性糖尿病動物模型，在18～20周齡時，其海馬組織開始出現較明顯的神經元細胞損傷及減少的形態學改變，22～24周齡時，這種改變更為顯著。益氣養陰散結復方可有效的干預和延緩KKAy小鼠海馬組織神經元的損傷和減少，這種對神經元的保護作用部分可能通過降低血糖、血脂而實現的，但其具體作用的環節和靶點，有待于進一步研究。

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Morphological changes in hippocampus and effect of Yiqi Yangyin Sanjie prescription on KKAy mice with spontaneous type 2 diabetes

TIAN Wenyang,LONG Hongzhu,WU Shuxin,SUN Hongfeng,BAI Ying,YANG Xiaohui*

(Dongfang Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100078,China)

Objective To observe the morphological changes of the hippocampus of the KKAy mice and the effect of traditional Chinese medicine compound on the morphology of hippocampus.Methods The 12-week-old male KKAy mice were randomly divided into model group and TCM group,same age of male C57BL/6J mice were chose as the normal group.The mice of different groups were treated with relevant medicinal respectively by intragastrical method,as the TCM group were fed with Traditional Chinese medicine compound,the model group and normal group were fed with distilled water.The hippocampal pathological changes were observed under light microscope and counted the number of hippocampal neurons after mice were sacrificed respectively when the end of 4th,8th and 12th weeks.Results At the end of 4th,8th and 12th weeks,in the model group and TCM group,the number of hippocampal neurons have significantly statistical differences compared with the normal group (P<0.05).At 8 weeks,the morphology of neurons in CA1 area of hippocampus were changed.The cell nuclei of some neurons appear to shrink and cytoplasm increased,the neuronal loss decrease.At 12 week,in the model group,the morphology of the hippocampus of the KKAy were significant abnormality.In TCM group,the pathological changes of the hippocampus of KKAy mice were significantly less than that of the mod-el group,the number of hippocampal neurons have significantly statistical differences compared with the model group (P<0.05).Conclusion At 18-20 week of age,the morphology of hippocampus of KKAy mice began to appear obvious changes.At 22-24 week of age,the pathological changes were more significant.The Chinese medicine compound can effectively prevent and reduce the damage of neurons of the hippocampus of KKAy mice.

diabetic encephalopathy;hippocampus tissue;traditional Chinese medicine compound;KKAy mice

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.06.010

教育部高等學校博士學科點專項科研基金(博導類)(20110013110004)。

田文楊(1990-)，女，碩士研究生，主要從事中醫藥防治糖尿病及并發癥研究。

R285.5

A

2095-6258(2016)06-1129-04

輯：張海洋

2016-04-06)

*通信作者：楊曉暉，男，教授，主任醫師，博士研究生導師，電子信箱-yxh0616@126.com