豬脾轉移因子的制備和生物學活性研究

杜聯峰，夏嬙，余妍，楊瑞，郭錦錦，孫萬邦，朱進軍

(遵義醫學院珠海校區·貴州省免疫學研究生教育創新基地，廣東 珠海 519041)

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豬脾轉移因子的制備和生物學活性研究

杜聯峰，夏嬙，余妍，楊瑞，郭錦錦，孫萬邦，朱進軍

(遵義醫學院珠海校區·貴州省免疫學研究生教育創新基地，廣東 珠海 519041)

目的：采用凍融-透析法制備豬脾轉移因子，并對其理化性質以及免疫學生物學活性、生物安全性進行初步檢定。方法：采用低溫勻漿反復凍融新鮮的豬脾臟、無菌離心勻漿脾臟組織液，取上清液透析制備轉移因子；以改良Lowry法分別檢測多肽含量，并進行理化指標、無菌試驗、熱原質試驗及其生物學活性檢測。結果：凍融-透析法制備豬脾轉移因子的理化性狀符合《中國生物制品》的要求；無菌試驗、熱原質試驗均為陰性；安全試驗合格；淋巴細胞轉化試驗和E花環形成試驗證實其具有刺激淋巴細胞增殖生物學活性。結論：成功制備了豬脾臟轉移因子，其各項理化指標符合生物制品規程的要求，同時具有較好的非特異性免疫學的生物學活性。

轉移因子；非特異性免疫學生物學活性；理化性質

轉移因子(transfer factor，TF)是從具有免疫活性的淋巴細胞中所釋放出的一種具有生物學活性的物質，免疫活性淋巴細胞在抗原刺激下釋放的TF能使未致敏的淋巴細胞轉化為具有免疫活性的淋巴細胞，又能增強巨噬細胞的功能，以利于殺滅細胞內感染的病原微生物(各種病毒、細菌、霉菌及寄生蟲等)，增強機體的免疫功能。TF主要成分是活性多肽，具有分子量小、無種屬特異性、無免疫原性、不易引起超敏反應等諸多優點[1]。并且在臨床治療先天或后天免疫缺陷病、各種病毒感染性疾病等方面的取得了較好的療效，因此TF在臨床上應用有一定的應用前景[2-3]。近年來，隨著各種新發傳染病如：SARS、H7N9等病毒性傳染病以及過敏性疾病在臨床上出現越來越多，轉移因子作為一種免疫調節劑受到國內外學者的廣泛關注[4]。本研究采用凍融-透析法制備TF，并研究其理化性質和體外的非特異免疫學生物學功能，為豬脾轉移因子的生產和應用上提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與器材

昆明小鼠，20 g左右，10只，遵義醫學院珠海校區實驗動物中心提供；健康家兔，3～4 kg左右，6只，遵義醫學院珠海校區實驗動物中心提供；新鮮豬脾臟，細胞計數板，顯微鏡，ELx-800型酶標儀。

1.2 實驗試劑

EZ-SepTMMouse小鼠脾淋巴細胞分離液購自達科為生物技術有限公司，Cell Counting Kit-8( CCK-8)試劑購自日本同仁化學公司，RPMIl64O 培養液購自Gibico公司，胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)購自Hyclone公司。其余試劑為國產分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 透析法制備豬脾轉移因子 將新鮮豬脾放于潔凈方盤中，去除其筋膜、脂肪，然后用無菌三蒸水沖洗3次，剪成細小的碎塊，稱量后放入電動高速組織搗碎機中，按1:1比例加入無菌三蒸水，高速勻漿2 min。勻漿后的漿體用潔凈的方盤盛裝，放入-20 ℃低溫冰箱中冷凍，在于37 ℃水浴中融化，反復凍融3次 ，3 000 r/min離心10 min，將上清液裝入透析袋，放入按1∶1比例加入無菌三蒸水，于4 ℃透析，每12 h換液，換液兩次，收集透析液，過濾除菌，分裝，-20 ℃保存備用。

1.3.2 理化性狀的檢定 采用肉眼觀察豬脾轉移因子的顏色及其表觀性狀；測量pH值；紫外分光光度計進行多波長掃描，計算260 nm/280 nm OD值比值；改良Lowry法檢測多肽的含量。并參照《中國生物制品規程》[9]進行無菌試驗、熱原質試驗和安全試驗。

1.3.3 豬脾轉移因子生物學活性檢測 (1)淋巴細胞轉化試驗：采用密度梯度離心法分離提取小鼠脾淋巴細胞，斷頸處死小鼠，浸泡于75%的酒精中，在超凈臺內無菌取出小鼠脾臟，在培養皿中放入8 mL EZ-SepTMMouse 1×淋巴細胞分離液，用玻璃注射器芯將脾臟在400目金屬網上輕輕地研磨，取細胞懸液立即轉移到15 mL離心管中，輕輕加入500 μL的RPMI 1640培養基液覆蓋(保持液面分界明顯)。室溫，800 g離心30 min，離心結束后細胞分層。吸取淋巴細胞層加入到另1只15 mL離心管中，再加入10 mL 1640培養基，顛倒洗滌。室溫，250 g離心10 min收集細胞，傾倒上清液，再用無菌Hank’s液輕輕吹打混勻洗滌細胞兩遍后，用含10%FBS 的RPMI 1640培養基重懸細胞，臺盼藍染色細胞計數，活細胞數大于97%以上，調整細胞數量至1×105個/mL，細胞懸液鋪96孔板，每孔100 μL。細胞置37 ℃，5%CO2培養箱中培養。實驗設實驗組、陰性對照組及陽性對照組，每組設4個復孔，實驗組加入豬脾轉移因子使其終濃度為：實驗分為實驗組(分為4個濃度梯度)、PHA陽性對照組、陰性對照組。每組設4個復孔，實驗組根據測量的轉移因子原液多肽含量進行稀釋，每孔加入5 μL，終濃度為1 mg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL，陽性對照組加入PHA使其終濃度為5 μg/mL。細胞置37 ℃，5%CO2培養箱中培養72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續孵育3 h后，酶標儀450 nm測量A值。(2)E玫瑰花環形成試驗檢測轉移因子生物活性：無菌抽取3 mL EDTA抗凝人靜脈血，加入等量Hank’s液混勻后，用毛細吸管將其轉移至3 mL人淋巴細胞分離液上，1 500 r/min，離心15 min，離心后，吸取淋巴細胞放入另一15 mL離心管中，加適量Hank’s液洗滌，輕輕吹打混勻，1 500 r/min，離心5 min，棄去上清液，洗滌3次后，在沉淀物中加入適量RPMI 1640液，混勻，分成兩份，一份在45 ℃恒溫水浴保溫30 min(每隔5 min振搖1次)，以1 500 r/min離心3～5 min，棄去上清液，再加入適量RPMI 1640液，混勻后，置45 ℃恒溫水浴保溫30 min，取出后以每分鐘1 500 r/min離心5 min，棄上清液。用Hank’s液洗滌3次，再用Hank’s液適當稀釋并計數，使最終濃度為每1 mL中5×106個細胞，為脫E受體外周血單個核細胞懸液。另一份用RPMI 1640液調節使其終濃度為5×106/mL，為未脫E受體外周血單個核細胞懸液。同時取適量綿羊血，用Hank’s液洗滌綿羊紅細胞3次。加適量Hank’s液稀釋并計數，使最終濃度為脫E受體外周血單個核細胞濃度的10倍(5×107/mL)。實驗設實驗組、陰性對照組及陽性對照組，實驗組分為4個濃度梯度，分別為1 mg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL。取6支小試管，1支陽性對照管中加未脫E受體T細胞懸液0.2 mL；1支陰性對照管中加脫E受體胸腺T細胞懸液0.2 mL；4支各加不同濃度轉移因子溶液0.1 mL作測定管，測定管中各加脫E受體胸腺T細胞懸液0.2 mL；37 ℃保溫1 h后，加入綿羊紅血球懸液0.2 mL，搖勻，以500 r/min離心3 min，放入4 ℃冰箱過夜，次日取出，棄上清液，每管中各加入0.8%戊二醛固定液0.1 mL，輕輕搖勻，靜置10 min，加入吉姆薩染色液2滴并搖勻，靜置15 min后開始計數，統計實驗各組的E玫瑰花環結合的細胞數求得E玫瑰花結合百分率。

1.4 統計學分析

將所得數據以平均值±標準差表示，用方差分析軟件SPSS 19.0中的One-way ANOVA進行方差分析。

2 結果

2.1 理化指標的檢測

轉移因子的理化指標均符合2008版《中國生物制品規程》的要求(表1)。

表1 豬脾轉移因子的理化性狀結果

2.2 豬脾轉移因子生物學活性檢測

2.2.1 淋巴細胞增殖試驗結果 淋巴細胞在培養72 h后加入CCK-8試劑繼續培養3 h后檢測，結果顯示陽性對照(PHA)組與陰性對照組相比可以明顯促進小鼠脾細胞的增殖(P<0.05)，各實驗組與陰性對照組可以明顯促進小鼠脾細胞的增殖(P<0.05)，其中 500 μg/mL和250 μg/mL組濃度的A值較高，與陰性對照組相比差異有顯著性差異(P<0.05)，說明我們制備的TF在500 μg/mL或250 μg/mL可以明顯促進小鼠脾細胞的增殖。與陽性對照(PHA)組相比無顯著差異(P>0.05)，而1 mg/mL和125 μg/mL組的淋巴細胞增殖試驗結果和陰性對照組比較無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 不同濃度轉移因子對小鼠脾淋巴細胞增殖的作用

*P<0.05，與陰性對照組比較。

2.2.2 E玫瑰花環形成試驗結果 各實驗組與陰性對照組E花環形成率均有化明顯增加，與陰性對照組比較有顯著性差異(P<0.05)，其中500 μg/mL和250 μg/mL組，E花環形成率較高，分別為37.7%和39.1%，較陰性對照增加了17%以上。而1 mg/mL和125 μg/mL組的E花環形成率分別為27%和24.5%，低于500 μg/mL和250 μg/mL組，說明TF對T細胞的刺激作用沒有明顯的量效關系。

*P<0.05，與陰性對照組比較。

3 討論

TF的制備方法有很多種，主要有透析法、超濾法等[5-6]。透析法是制備TF常用的標準方法，它不需離心和專業的超濾設備，是一種適合實驗室生產TF的常用方法。超濾法是一項在壓力驅動下的膜過濾技術，是近年來隨著對生物膜機制的深入研究和認識發展起來的一種新技術，現在超濾法已經逐漸成為適于轉移因子的工業化大規模生產的主要方法。超濾法相對透析法來說需要專業的超濾設備，而且在超濾前需要通過離心和蛋白質沉淀技術去除大分子蛋白和雜質，生產步驟相對繁瑣，但它產率高，適合工業化生產[10]。本實驗通過凍融-透析法成功地制備了豬脾TF，新鮮豬脾經高速勻漿后，放入-20 ℃低溫冰箱中凍存，再進行融化，經透析、過濾除菌即可以制得豬脾TF，此法既簡單又經濟，適合實驗室小量生產和研究[7-8]。在制備過程中發現，提高TF多肽含量的關鍵步驟是在于脾臟勻漿的凍融的次數，對TF的收率和質量有很大的影響，在凍融過程中破壞細胞，使細胞內的小分子多肽和多核甘酸完全釋放出來，凍融次數多可以提高TF多肽的含量，但是凍融次數越多，其產品中核糖和多肽的比值就越低，而且容易受到細菌的污染。同時因為TF在高溫下容易失去活性，所以相應的操作步驟應在低溫下進行，如勻漿、透析的操作過程都應在4℃條件下進行。

本實驗還通過淋巴細胞轉化試驗檢和E花環實驗檢測制備的TF非特異性免疫學生物學活性，實驗證實制備的TF在500 μg/mL和250 μg/mL濃度下具有較好的刺激小鼠淋巴細胞轉化增殖的能力和較高E花環形成率。說明我們制備的豬脾TF在500 μg/mL和250 μg/mL濃度下能夠有效的增強機體非特異性免疫能力。我們所采用凍融-透析法制備豬脾TF的方法是一種有效、可行的實驗方法。目前隨著人口的老齡化，和后天性免疫缺陷病(如AIDS)的增加，在臨床上出現越來越多病毒性傳染病以及過敏性疾病，轉移因子作為一種免疫調節劑，在臨床上有廣泛的應用前景，并且取得了較好的效果[11-13]。

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(學術編輯：楊健)

本刊網址：http：//www.nsmc.edu.cn

作者投稿系統：http：//noth.cbpt.cnki.net

郵箱：xuebao@nsmc.edu.cn

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Preparation and biological activity research of porcine spleen transfer factor

DU Lian-feng，XIA Qiang，YU Yan，YANG Rui，GUO Jin-jin,SUN Wan-bang，ZHU Jin-jun

(ZunyiMedicalCollegeZhuhaiCampus，GraduateEducationandInnovationBaseofImmunologyinGuizhouProvince,Zhuhai519041,Guangdong,China)

Objective：Preparing pig spleen transfer factor by freeze thaw dialysis method,to preliminarily study the physicochemical properties,the biological activity of immunology and biological safety.Methods：Freezing and thawing fresh pig spleen by cryogenic homogenization repeatedly,getting supernatant dialysis from aseptic centrifugal homogenate of spleen tissue fluid to prepare the transfer factor.The content of polypeptide was detected respectively by modified Lowry polypeptide content;the physicochemical indexes,sterility test,pyrogen test and biological activity were detected too.Results：The physicochemical properties of pig spleen transfer factor by freeze thaw dialysis method consists with “China Biological Products” requirement;sterility test and pyrogen test are negative;safety tests is qualified;lymphocyte transformation test and E rosette formation test confirms that it has to stimulate lymphocyte proliferation biological activity.Conclusion：Successfully preparing pig spleen transfer factor,its physicochemical indexes are in line with the requirements for Biological Products,and have good biological activity of nonspecific immunology.

Transfer factor;Non-specific immunological biological activity;Physicochemical properties

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.02.10

貴州省教育廳自然科學項目(20090105)

2015-09-04

杜聯峰(1976-)，男，碩士，副教授。E-mail：8wy149842@163.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160425.1131.020.html

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