IL-1β、IL-6和TNF-α在肩袖損傷大鼠肩峰下滑囊中的表達及作用

鄭榮宗 樓超 童勇駿 黃淑明 吳泉州

IL-1β、IL-6和TNF-α在肩袖損傷大鼠肩峰下滑囊中的表達及作用

鄭榮宗 樓超 童勇駿 黃淑明 吳泉州

目的 觀察肩袖損傷大鼠肩峰下滑囊（SAB）中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達，并探討其在肩袖損傷后疼痛發生中的作用。方法 雌性SD大鼠在減少干擾SAB的情況下，切斷同側前肢岡上肌腱，建立大鼠肩袖損傷的模型作為實驗組，對側行假手術作為對照組。根據大鼠肩袖損傷時間不同，分別于造模后2、4、8周對大鼠SAB進行取樣，對標本進行切片，HE染色觀察SAB組織病理變化，采用免疫組化及實時RT-PCR測定SAB中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平。結果 與對照組相比，實驗組SAB中可見成纖維細胞數量和血管分布的增加。免疫組化及實時RT-PCR顯示實驗組的IL-1β、IL-6和TNF-α在SAB中的表達水平在各時間段均明顯升高（P＜0.05）。結論 肩袖損傷后大鼠SAB中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的升高可能是肩袖損傷后肩關節疼痛和功能障礙的病理機制之一。

細胞因子 肩袖 肩峰下滑囊 大鼠模型

肩袖損傷是引起肩周疼痛、肩關節功能障礙最常見的疾病之一，嚴重影響患者的生活質量[1-2]。目前對肩袖損傷引起肩關節疼痛的病因還沒有很好的認識。肩峰下滑囊（subacromial bursa，SAB）被認為與肩袖損傷引起的肩關節疼痛密切相關[3]。有研究發現，肩袖損傷引起肩關節疼痛的發生、發展與SAB內炎癥因子IL-1α、IL-1β和TNF-α等的高表達有關[4-6]。但Lho等[7]在凍結肩患者的SAB中僅發現IL-1α和TNF-α高表達。Szomor等[8]研究了17例肩袖損傷患者的SAB標本，均有表達IL-6，僅1例表達TNF-α mRNA，其余均無IL-1β mRNA的表達。而Ko等[9]對14例僵硬肩的肩袖損傷患者進行研究，發現SAB中IL-1β高表達。Yoshida等[10]發現，有粘連的凍結肩或肩袖損傷患者中，SAB中IL-8基因的表達增加，均未檢測到IL-1α、IL-1β和TNF-α等的表達。可見，臨床中受多因素影響，對于SAB內IL-1、IL-6和TNF-α等炎癥因子的表達與否，是否與肩關節疼痛的發生有關等問題還存在爭議，有待進一步深入研究。本研究旨在建立大鼠肩袖損傷模型，進而探討IL-1β、IL-6和TNF-α在肩袖損傷大鼠SAB中的表達及作用。

1 材料和方法

1.1 材料 骨骼成熟的清潔級SD大鼠12只，雌性，鼠齡3個月，平均體重270（250～300）g，術前觀察1周，確認體健無疾病。大鼠由溫州醫科大學實驗動物中心提供。本實驗通過溫州醫科大學動物實驗倫理委員會倫理審查。

1.2 實驗方法 大鼠肩袖損傷模型制備：12只SD大鼠稱重后，按40mg/kg體重量腹腔注射戊巴比妥鈉進行麻醉[11]，將其以俯臥位固定于鼠類固定器上。術區備皮、清潔，常規消毒，鋪無菌單。肩袖損傷組（實驗組）建立肩袖損傷模型，手術入路采用大鼠右側前肢肩胛岡肩峰端1cm皮膚切口，沿肩胛岡上緣向肩峰方向尋找并挑起岡上肌腱，在不影響SAB的情況下銳性切斷岡上肌肌腱，造成全層肩袖損傷模型。檢查無活動性出血后采用5-0可吸收縫線（強生公司）關閉切口。假手術組（對照組）作左側前肢肩關節后外側1cm切口，暴露岡上肌腱后同樣方式縫合關閉切口。術后分籠飼養，無活動限制。

1.3 標本采集及處理 分別于術后2、4、8周各取4只大鼠注射過量的戊巴比妥處死，兩側（肩袖損傷模型建立側及假手術側）SAB進行觀察。原切口進入，仔細分離軟組織，尋找SAB并予切除作為標本。每1例標本分為2部分，一部分置于深低溫冰箱中保存，用于后續細胞總RNA和蛋白的提取，進行RT-PCR檢測。另一部分立即置于10%多聚甲醛溶液中，固定48h，石蠟包埋。沿標本縱軸切片，片厚度4μm。石蠟切片行HE染色和免疫組化。同時切取岡上肌腱斷端處部分肌腱作HE染色觀察造模情況。

1.4 HE染色 用HE染色觀察SAB組織病理變化。切片置二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蘇木素染液染色5min，自來水沖洗，分化液分化30s，自來水浸泡15min，伊紅染液染2min，流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片后顯微鏡下觀察。

1.5 免疫組化 用免疫組化分別觀察IL-1β、IL-6和TNF-α在SAB中的表達。石蠟切片（厚4μm）逐級二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，PBS緩沖液洗，分別經PBS、雙氧水室溫孵育10min阻斷內源性過氧化物酶，用胰蛋白酶37℃孵育30min修復抗原，正常山羊血清室溫下封閉30min，滴加一抗兔抗人單克隆抗體（美國Thermo公司），4℃孵育過夜。第2天復溫后經山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體（北京中杉金橋生物技術有限公司）37℃孵育30min，然后用鏈霉親和素-生物素復合物（strept avidin-biotin complex，SABC）37℃孵育30min，二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蘇木素復染核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.6 RT-PCR法檢測IL-1β、IL-6和TNF-α表達

1.6.1 RNA提取 將標本從液氮中取出，立刻稱重。將組織置于預冷的研缽中，邊加液氮邊研磨，直至成為碎末狀。每100mg組織加入TRIZOL試劑（美國Sigma公司）200μl至樣品中，裂解后15～30℃孵育5min。將裂解產物移至RNase.free的1.5ml離心管中，每管1ml。加入預冷的氯仿，200μl/管，渦旋混勻，冰浴10min，4℃，12 000r/min離心15min，小心吸取上層水相至新管。加入1.5倍體積的無水乙醇，混勻，-80℃沉淀1h。4℃，12 000 000r/min離心30min，棄上清液。加入體積分數為80%的乙醇1ml/管，4℃，12 000 000r/min離心10min，棄上清。吸凈殘液，開蓋，晾干5min，加入焦碳酸二乙酯（DEPC）水20μl/管，溶解沉淀。使用NanoDrop@ND-1000紫外吸收法測定RNA濃度和純度。

1.6.2 cDNA合成 配制退火混合物：RNA3μg，0.5g/L Oligo（dT）（美國Thermo公司）1μl，加無RNA酶的H2O至總體積10μl。在70℃水浴（DK-8D型電熱恒溫水槽，上海森信實驗儀器有限公司）3min，降到37℃放置10min。

1.6.3 SYBR Green熒光定量RT-PCR 按照SYBR Green熒光定量RT-PCR試劑盒說明，RT-PCR反應體系為：cDNA模板2μl，ddH2O 8.5μl，SYBR Green PCR Mix 12.5μl，引物2μl,總體系為25μl。IL-1β、IL-6和TNF-α引物的正反義序列見表1。反應條件為：95℃60s，95℃15s，60℃15s，72℃45s，共36個循環。同時作65～95℃溶解曲線（圖1，見插頁）。所有樣本均作3次檢測，取平均值進行分析。RT-PCR數據的收集主要由7000 Sequence De-tection System自帶軟件完成，通過軟件計算所有樣品的Ct值，用相對定量的方法分析數據，計算各組目的基因表達的差異。

1.7 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件；計量資料以表示，RT-PCR檢測IL-1β、IL-6和TNF-α的 mRNA表達量采用單因素方差分析，組間比較采用SNK法。

2 結果

2.1 實驗動物數量分析 12只SD大鼠在術后健康狀況良好，均于造模當天開始自主進食，術后進食情況良好。觀察期間無傷口感染及非預計性死亡發生。在建模操作過程中，手術入路的相關解剖位置比較恒定，模型建立的操作過程可重復性高。所有大鼠均進入結果分析。

表1 RT-PCR使用引物序列

2.2 局部組織學肉眼觀察 術后2、4、8周，各實驗組大鼠肩袖損傷處均有不同程度的瘢痕組織填補修復，周圍粘連均可見。可見岡上肌斷端肌腱瘢痕組織明顯增生，且隨時間增加瘢痕組織范圍逐漸增大。對照組無瘢痕組織填補修復，無周圍粘連。

2.3 HE染色光學顯微鏡觀察 肩袖損傷側在第4周和第8周時岡上肌腱中可見成纖維細胞積聚，膠原排列相對紊亂。而對側假手術只見極少量的成纖維細胞出現，膠原呈波浪狀，單軸性（圖2，見插頁）。

在實驗組所有肩袖損傷大鼠的SAB組織，均可見成纖維細胞數量和血管分布的增加。而對側假手術SAB中成纖維細胞數量和血管分布均很少（圖3，見插頁）。

2.4 免疫組化普通光學顯微鏡觀察結果 實驗組肩袖損傷大鼠SAB組織細胞均能檢測到IL-1β、IL-6和TNF-α陽性表達，且表達分布高于對照組（圖4-6，見插頁）。

2.5 實時熒光定量PCR檢測 實驗組SAB中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA在術后2、4、8周時的表達量明顯較對照組升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖7-9。

圖7 兩組SAB中IL-1βmRNA在術后2、4、8周的表達量

圖8 兩組SAB中IL-6 mRNA在術后2、4、8周的表達量

圖9 兩組SAB中TNF-α mRNA在術后2、4、8周的表達量

3 討論

SAB位于三角肌深面筋膜、肩峰及喙肩韌帶的下方，覆蓋在岡上肌腱、二頭肌間溝的淺層。為了造成大鼠肩袖全層撕裂損傷，若按Soslowsky等[12]的肩袖損傷模型切斷肩袖肌腱，必然要顯露和切開SAB的頂部和底部，這樣對實驗結果就會造成影響，因為切開SAB會激活相關細胞因子的表達。為了減少對SAB的干擾，本研究在造模時沿大鼠前肢肩胛岡肩峰端切斷岡上肌，避免肱骨大結節、肩峰下進入對SAB的干擾。根據組織學肉眼及HE染色光學顯微鏡觀察損傷肩袖造模術后不同時期各實驗組大鼠肩袖損傷處均有不同程度的瘢痕組織填補修復，可見成纖維細胞積聚。本研究認為，通過這種方式建模，手術入路的相關解剖位置比較恒定，模型建立的操作過程可重復性高。

肩袖損傷患者疼痛的機制目前尚不清楚，關于肩袖損傷患者疼痛機制的研究主要集中在炎癥性疼痛和神經源性疼痛兩個方面。炎癥是機體對體內外致炎因素引起的損傷所發生的防御反應，最近研究發現，肩關節疼痛的發生、發展與SAB的炎癥有密切的聯系[5-7，13]。IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子已被證實與疼痛有關，同時在肩袖損傷患者的肩袖和SAB中可以檢測到有炎癥因子存在[9，14-15]。Voloshin等[5]在一項對104例患者SAB進行活檢的組織學研究中發現，與對照組相比，肩峰撞擊綜合征和肩袖損傷患者的急慢性炎癥因子相比較而言在組織學上更常見，而且這種細胞因子水平的高低與損傷的嚴重程度相關，翻修手術與全層肩袖撕裂患者中表達水平更高。本研究發現，在肩袖損傷造模的2周其SAB的IL-1β、IL-6和TNF-α細胞因子表達水平明顯高于4周和8周，這可能與肩袖在修復過程有關。因此可以認為SAB中炎癥因子的表達水平升高可能是肩袖損傷疾病的一個重要病理生理過程。

IL-1β和TNF-α作為始動因子，通過改變COX-2水平來調節疼痛[16]。IL-6作為炎癥介質被認為是TNF-α等某些生物效應的放大因子。SAB中IL-1β的表達增加與肩袖損傷患者疼痛增加相關[4]。SAB組織同骨關節炎滑膜具有相似的滑膜細胞微環境（基質細胞、成纖維細胞樣滑膜細胞），相似的細胞類型和病理特征。因此，可以想象，這些炎癥因子也可能與肩袖損傷患者SAB發生病理改變相關。本研究發現，與對照組相比，實驗組SAB中可見細胞數量和血管分布的增加。免疫組化及實時RT-PCR顯示實驗組的IL-1β、IL-6和TNF-α在SAB中的表達水平在各時間段均明顯升高，這與Voloshin等[5]在肩袖損傷患者的SAB研究發現基本相符。因此，本研究認為肩袖損傷導致的SAB慢性炎癥反應是導致肩袖疾病患者肩痛及功能障礙的重要原因。

當然本研究也存在一些不足，如研究的樣本量相對偏小，研究中所使用的實驗技術還不夠精確及完善，而且只納入IL-1β、IL-6和TNF-α 3個炎癥因子，還不能完全證實本研究的結論。此外，沒有檢測基質金屬蛋白酶和生長因子水平，而這兩個指標被證實與肩袖損傷的發生發展密切相關。雖有上述不足，但本研究較早且相對完整地研究肩袖損傷后SAB中炎癥因子的變化，對臨床上解釋肩袖損傷后疼痛的發生、發展有重要的參考意義。

綜上所述，本研究結果提示，肩袖損傷后SAB中IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯升高，提示該變化可能是肩袖損傷后引起肩關節疼痛和功能障礙的發病機制之一。后期需要更多的研究進一步明確上述炎癥因子通過何種通路誘發肩關節疼痛。

[1] BediA,Dines J,Warren R F,et al.Massive tears of the rotator cuff [J].J Bone Joint Surg Am,2010,92(9):1894-1908.

[2] JoshiS K,Kim H T,Feeley B T,et al.Differentialubiquitin-proteasome and autophagy signaling following rotator cuff tears and suprascapular nerve injury[J].J Orthop Res,2014,32(1):138-144.

[3] Gotoh M,Hamada K,Yamakawa H,et al.Increased substance P in subacromialbursa and shoulder pain in rotator cuffdiseases[J]. J Orthop Res,1998,16(5):618-621.

[4] Gotoh M,Hamada K,Yamakawa H,et al.Interleukin-1 induced glenohumeral synovitis and shoulder pain in rotator cuff diseases [J].J Orthop Res,2002,20(6):1365-1371.

[5] Voloshin I,Gelinas J,Maloney M D,et al.Proinflammatory cytokines and metalloproteases are expressed in the subacromial bursa in patients with rotator cuff disease[J].Arthroscopy,2005, 21(9):1076.e1-1076.e9.

[6] Blaine T A,Kim YS,Voloshin I,et al.The molecular pathophysiology of subacromial bursitis in rotator cuff disease[J].J Shoulder and Elbow Surg,2005,14(1):S84-S89.

[7] Lho YM,Ha E,Cho C H,et al.Inflammatory cytokines are overexpressed in the subacromial bursa of frozen shoulder[J].J Shoulder and Elbow Surg,2013,22(5):666-672.

[8] Szomor Z L,Wang M X,Kruller A,et al.Differential expression of cytokines and nitric oxide synthase isoforms in human rotator cuff bursa[J].Ann Rheum Dis,2001,60(4):431-432.

[9] Ko J Y,Wang F S,Huang H Y,et al.Increased IL-1beta expression and myofibroblast recruitment in subacromial bursa is associated with rotator cuff lesions with shoulder stiffness[J].J Orthop Res,2008,26(8):1090-1097.

[10] Yoshida M,Funasaki H,Saito M,et al.Pathologic gene expression in adhesive subacromial bursae of human shoulder[J].Clin Orthop Relat Res,2003(412):57-64.

[11] HironoriY,Nobuyasu O,TomonoriK,et al.Assessment of painrelated behavior and pro-inflammatory cytokine levels in the rat rotator cufftear model[J].J Orthop Res,2013,32(2):286-290.

[12] Soslowsky L J,Carpenter J E,DeBano C M,et al.Development and use ofan animalmodelfor investigations on rotator cuffdisease[J].J Shoulder and Elbow Surg,1996,5(5):383-392.

[13] TzuzakiM,Guyton G,Garret W,et al.IL-1 beta induces COX-2, MMP-1,-3,and-13,ADAMTS-4,IL-1 beta,and IL-6 in human tendon cells[J].J Orthop Res,2003,21(2):256-264.

[14] Yamazaki H,Ochiai N,Kenmoku T,et al.Assessment of painrelated behavior and pro‐inflammatory cytokine levels in the rat rotator cufftear model[J].J Orthop Res,2014,32(2):286-290.

[15] Bunker T D,Reilly J,Baird K S,et al.Expression of growth factors,cytokines and matrix metalloproteinases in frozen shoulder [J].J Bone Joint Surg Br,2000,82(5):768-773.

[16] Feldmann M,Brennan F M,Maini R N.Role of cytokines inrheumatoid arthritis[J].Annu Rev Immunol,1996,14(1):397-440.

Expression of IL-1β，IL-6，TNF-α in subacromial bursa of rat rotator cuff tear model

ZHENG Rongzong,LOU Chao,TONG Yongjun,et al.Department of Orthopedics,Lishui Central Hospital,Lishui 323000,China

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of interleukin-1β (IL-1β),interleukin-6(IL-6)and tumor necrosis factor α(TNF-α)in subacromial bursa(SAB)of rat rotator cuff tear model. Methods The rotator cuff tear model was induced by SAB sparing supraspinatus tenotomy in the right shoulders of 12 adult female Sprague-Dawley rats(experimental group),and 12 left shoulders underwent sham surgery as control group.The subacromial bursas were obtained from 4 rats each time at postoperative 2,4,8 weeks.The histological changes were observed by hematoxylin-eosin(HE)staining.The expression of IL-1β,IL-6 and TNF-α proteins and mRNA were measured by immunohistochemistry and real-time reverse transcriptasepolymerase chain reaction(RT-PCR),respectively. Results HE staining showed that there were increase of cell numbers and vascularization in experimental group compared with control group.The expressions of IL-1β,IL-6 and TNF-α proteins and mRNA were significantly higher in experimental group than those in control groups at all time points(P＜0.05). Conclusion These findings suggest that elevated levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in the subacromial bursa might be correlated with the pain and limited range of motion in ratator cuff tear.

Cytokine Rotator cuffSubacromialbursa Mouse model

2016-02-21）

（本文編輯：陳麗）

浙江省自然科學基金（Y16H060027）；浙江省醫藥衛生一般研究計劃（2012KYB249）

323000 麗水市中心醫院骨科（鄭榮宗、樓超、黃淑明、吳泉州）；浙江醫院骨科（童勇駿）

黃淑明，E-mail：smhuang001@163.com