DMOG促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞血管新生作用的研究

朱美飛 江榮林 雷澍 王靈聰 劉騫

DMOG促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞血管新生作用的研究

朱美飛 江榮林 雷澍 王靈聰 劉騫

目的 探討在缺氧缺血清環(huán)境下，脯氨酸羥化酶抑制劑——二甲基乙二酰甘氨酸（DMOG）促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）血管新生的作用及其機制。方法 MSCs從大鼠骨髓中分離得到，分為：常氧條件下溶劑對照組（N-DMSO）、缺氧條件下溶劑對照組（H-DMSO）、20μM DMOG加藥組（D-20μM）、100μM DMOG加藥組（D-100μM）及500μM DMOG加藥組（D-500μM），觀察以下指標(biāo)：（1）通過缺氧條件下CCK-8檢測DMOG在20μM、100μM及500μM劑量下對MSCs的保護(hù)作用，確定DMOG的最佳劑量；（2）通過Matrigel實驗觀察DMOG促進(jìn)MSCs血管新生的作用；（3）通過Western blot法檢測血管新生通路相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果 （1）不同濃度組DMOG對缺氧損傷MSCs的影響：N-DMSO組OD值3.25±0.05，H-DMSO組2.23±0.14，D-20μM組2.68±0.43，D-100μM組3.11±0.25，D-500μM組3.23±0.04。與N-DMSO組比較，H-DMSO組OD值降低（P＜0.01），與H-DMSO組比較，D-20μM組、D-100μM組、D-500μM OD值均升高（P＜0.05或0.01）。（2）不同濃度組DMOG對正常MSCs的影響：D-20μM組3.19±0.02，D-100μM組3.15±0.06，D-500μM組2.51±0.08。與N-DMSO組比較，D-500μM組OD值降低（P＜0.01），D-20μM組、D-100μM組與N-DMSO組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），提示DMOG在20μM及100μM對細(xì)胞無毒性。（3）血管新生相關(guān)蛋白的表達(dá)：與H-DMSO組相比，D-100μM組缺氧3、6及24h HIF-1α均增加（1.44±0.32 vs 7.79± 0.23，2.4±0.28 vs 3.51±0.79，0.93±0.37 vs2.46±0.07，P＜0.05或0.01），pAKT則在缺氧6h增加（0.47±0.15 vs 0.71±0.03，P＜0.05），VEGF在缺氧6、24h均增加（0.63±0.10 vs 0.87±0.14，0.42±0.06 vs 0.70±0.06，P＜0.05或0.01），以缺氧24h最為顯著。pmTOR/mTOR及pERK/ERK蛋白兩組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。結(jié)論 DMOG通過抑制HIF-1α降解及促進(jìn)AKT磷酸化提高缺氧環(huán)境下MSCs的血管新生能力。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 二甲基乙二酰甘氨酸 血管新生 缺氧

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一種非造血的多功能干細(xì)胞，它具有取材方便、來源充足、定向分化、無免疫排異等優(yōu)勢，是目前細(xì)胞治療心血管疾病的前沿?zé)狳c。現(xiàn)代研究表明，MSCs具有抗心肌細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞、促進(jìn)心臟交感神經(jīng)重構(gòu)、修復(fù)損傷的內(nèi)皮、改善心肌梗死后心室重塑、改善心功能降低梗死面積和促進(jìn)血管新生等作用[1-3]。然而在缺氧環(huán)境中MSCs存活率低，且療效不顯著。二甲基乙二酰甘氨酸（DMOG）是一種脯氨酞經(jīng)化酶抑制劑，能夠抑制細(xì)胞內(nèi)低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）的降解，繼而使細(xì)胞核內(nèi)很多基因（如促紅細(xì)胞生成素（EPO）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血管生成素1（Ang-1）和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（Glut-1）等的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)增高，繼而發(fā)揮保護(hù)作用。在體外的研究中發(fā)現(xiàn)，DMOG能夠改善心肌細(xì)胞和神經(jīng)元在缺血清或缺神經(jīng)營養(yǎng)因子等惡劣環(huán)境下的生存能力[4-5]，促進(jìn)MSCs動員[6]。但是，DMOG能否促進(jìn)缺氧條件下MSCs的血管新生能力及其可能的機制目前鮮有報道。本實驗通過研究DMOG在缺氧缺血清條件下促進(jìn)MSCs血管新生的能力，對其可能的機制進(jìn)行探討，以期對MSCs移植治療保護(hù)劑的開發(fā)提供一定的實驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 DMOG（美國Selleckchem公司）；一抗為HIF-1α（1∶1 000，英國Abcam公司）、pAKT（1∶1 000，美國CST公司）、AKT（1∶1 000，美國CST公司）、pmTOR（1∶1 000，美國CST公司）、mTOR（1∶1000，美國CST公司）、pERK（1∶1 000，美國CST公司）、ERK（1∶1 000，美國CST公司）、VEGF（1∶1 000，美國CST公司）、HRP-Actin（1∶10 000，中國康誠生物科技有限公司）；二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（1∶5 000，美國Santacruz公司）；Growth factor reduced matrigel（美國Corning公司）；CCK-8（日本Dojindo公司）；低糖DMEM（美國Invitrogen公司）、FBS（美國Gibco公司）。

1.2 方法

1.2.1 MSCs的分離鑒定 MSCs從6周齡大鼠的股骨和脛骨中分離得到，10%FBS低糖DMEM進(jìn)行培養(yǎng)，并且采用流式細(xì)胞術(shù)對 CD29、CD44、CD73、CD90及CD105等分子表型進(jìn)行鑒定[7]。

1.2.2 CCK-8細(xì)胞存活檢測 MSCs消化后接種于96孔板，3 000個細(xì)胞/孔，設(shè)5復(fù)孔，隔天貼壁后換液（2% FBS的DMEM培養(yǎng)液），分別設(shè)常氧DMSO（N-DMSO組）及給藥組（D-20μM組、100μM組、500μM組）、缺氧DMSO（H-DMSO）及給藥組（D-20μM組、100μM組、500μM）：加入DMSO及20、100和500μM DMOG，分別放入缺氧培養(yǎng)箱（0.1%O2/5%CO2）及常氧培養(yǎng)箱孵育48h，CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞存活。

1.2.3 管腔形成實驗 Matrigel每孔50μl加入96孔板，置于37℃孵育箱30min凝固后，將MSCs消化后以2%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸，5 000個細(xì)胞/孔接種入鋪有Matrigel的96孔板，分別設(shè)DMSO組與100μM濃度的DMOG組（D-100），加入DMSO及100μM DMOG后放入缺氧箱，6h后觀察MSCs的管腔形成作用，顯微鏡拍照（5×）。

1.2.4 血管新生相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 MSCs消化后接種于6孔板，2×105個細(xì)胞/孔，隔天貼壁后換液（2%FBS的DMEM培養(yǎng)液），加入DMSO及100μM DMOG后放入缺氧培養(yǎng)箱（設(shè)為H-DMSO組及D-100μM組），同時設(shè)正常對照組（N-DMSO）。分別缺氧3、6及24h后采用2.5×loading buffer收集蛋白，95℃煮30min后冰上冷卻上樣。SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉2h，分別加HIF-1α、pAKT、AKT、pmTOR、mTOR、pERK、ERK、VEGF、HRPActin抗體4℃孵育過夜，洗膜3次，加山羊抗兔二抗室溫孵育1 h，洗膜3次，ECL顯影，BioRad MP儀器曝光，用Image Lab軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Minitab 14統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用單因素方差（One way ANOVO）分析。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度組DMOG對缺氧損傷MSCs的影響 N-DMSO組OD值3.25±0.05，H-DMSO組2.23±0.14，D-20μM組2.68±0.43，D-100μM組3.11±0.25，D-500μM 3.23±0.04。與N-DMSO組比較，H-DMSO組OD值降低（P＜0.01），與H-DMSO組比較，D-20μM組、D-100μM組、D-500μM OD值均升高（P＜0.05或0.01）。

2.2 不同濃度組DMOG對正常MSCs的影響 N-DMSO組OD值3.25±0.05，D-20μM組3.19±0.02，D-100μM組3.15±0.06，D-500μM 2.51±0.08。與N-DMSO組比較，D-500μM OD值降低（P＜0.01），D-20μM組、D-100μM組與N-DMSO組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。因此確定DMOG最佳濃度為100μM。

2.3 DMOG對缺氧環(huán)境下MSCs的管腔形成作用的影響 見圖1。

圖1 Matrigel實驗測定管腔形成示意圖

由圖1可見，DMSO與100μM DMOG分別作用6h后，DMOG明顯促進(jìn)MSCs形成管腔。提示DMOG具有促進(jìn)MSCs血管新生的作用。

2.4 血管新生相關(guān)蛋白的表達(dá) 見圖2、表1。

圖2 血管新生相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較圖

表1 血管新生相關(guān)蛋白的表達(dá)

由圖2及表1可見，與H-DMSO組相比，D-100μM組缺氧3、6及24h HIF-1α均增加（P＜0.05或0.01），pAKT則在缺氧6h增加，VEGF在缺氧6、24h均增加（P＜0.05或0.01），以缺氧24h最為顯著。pmTOR/mTOR及pERK/ERK蛋白兩組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

3 討論

HIF-1是血管新生的調(diào)控者，隨著細(xì)胞內(nèi)氧濃度變化而調(diào)節(jié)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活因子。HIF-1由調(diào)節(jié)亞單位HIF-1α及結(jié)構(gòu)亞單位HIF-1β組成。在常氧條件下，細(xì)胞內(nèi)HIF-1α不穩(wěn)定，可通過泛素蛋白酶體降解；在低氧條件下，HIF-1α穩(wěn)定性增加，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與HIF-1β組成二聚體，與細(xì)胞核染色體上的順式作用元件HRE相互作用，從而調(diào)控包括VEGF在內(nèi)的多種下游基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[8-9]。因此，抑制HIF-1α的降解、促進(jìn)其合成及誘導(dǎo)VEGF基因表達(dá)，對于調(diào)控血管新生等低氧應(yīng)答反應(yīng)具有重要意義。HIF-1α是脯氨酸羥化酶唯一的底物。脯氨酸羥化酶抑制劑可以抑制HIF-1α的羥化，減少常氧狀態(tài)下HIF-1α的降解，從而穩(wěn)定HIF-1α的表達(dá)，激活HIF-1α下游信號通路[10]。DMOG為酮戊二酸類似物，通過與內(nèi)源性的2-酮戊二酸競爭從而抑制脯氨酸羥化酶[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)DMOG對缺氧、缺血清損傷的MSCs具有明顯的保護(hù)作用，并且能夠促進(jìn)缺氧環(huán)境下MSCs的血管新生作用，提示DMOG處理后可促進(jìn)MSCs在心肌缺血環(huán)境存活及提高其血管新生能力。

本實驗還對DMOG處理后其誘導(dǎo)MSCs血管新生的相關(guān)通路蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果提示一方面DMOG可能通過抑制HIF-1α的降解上調(diào)其蛋白表達(dá)促進(jìn)其下游調(diào)控基因VEGF的蛋白表達(dá)，另一方面其還能通過促進(jìn)AKT磷酸化激活下游血管新生相關(guān)蛋白如VEGF等的蛋白表達(dá)，這兩方面的共同作用導(dǎo)致其血管新生作用效果顯著。

綜上所述，DMOG在100μM時促進(jìn)缺氧環(huán)境下MSCs細(xì)胞存活及血管新生效果顯著，其可能通過抑制HIF-1α的降解上調(diào)VEGF水平及促進(jìn)AKT磷酸化發(fā)揮作用。

[1] Numasawa Y,Kimura T,Miyoshi S,et al.Treatment of human mesenchymal stem cells with angiotensin receptor blocker improved efficiency of cardiomyogenic transdifferentiation and improved cardiac function via angiogenesis[J].Stem Cells,2011,29 (9):1405-1414.

[2] Li Y,Hiroi Y,Ngoy S,et al.Notch1 in Bone Marrow-Derived Cells Mediates Cardiac Repair After Myocardial Infarction[J].Circulation,2011,123(8):866-876.

[3] 彭余江,李慧勇,何璽君.神經(jīng)生長因子轉(zhuǎn)染的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)的實驗研究[J].浙江醫(yī)學(xué),2015,37(3): 197-199,215.

[4] Zhang S,Ma K,Liu Y,et al.Stabilization of Hypoxia-inducible Factor by DMOG Inhibits Development of Chronic Hypoxia-Induced Right Ventricular Remodeling[J].J Cardiovasc Pharmacol, 2016,67(1):68-75.

[5] Lomb D J,Straub J A,Freeman R S.Prolyl hydroxylase inhibitors delay neuronal cell death caused by trophic factor deprivation[J]. J Neurochem,2007,103(5):1897-906.

[6] 胡韶君,余勤,劉麗珍,等.HIF-1信號通路在介導(dǎo)DMOG動員MSCs中的作用[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2015,25(1):9-14.

[7] Chen H Q,Liu X B,Zhu W.SIRT1 ameliorates age-related senescence of mesenchymal stem cells via modulating telomere shelterin[J].Front Aging Neurosci,2014,6:103.

[8] 彭勇,陳勇,鄔秀娣,等.HIF-1α及VEGF在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞中的表達(dá)及意義[J].浙江醫(yī)學(xué),2013(18):1628-1631,1643.

[9] 葉鳴,王志剛,李興升.HIF-1α在缺血性心血管疾病中作用的研究進(jìn)展[J].心臟病雜志,2010,22(5):758-759.

[10] Liu X,Tu Y,Zhang L,et al.Prolyl hydroxylase inhibitors protect from the bone loss in ovariectomy rats by increasing bone vascularity[J].CellBiochem Biophys,2014,69(1):141-149.

[11] Rahman S U,Lee MS,Baek J H,et al.The prolylhydroxylase inhibitor dimethyloxalylglycine enhances dentin sialophoshoprotein expression through VEGF-induced Runx2 stabilization[J]. PLoS One,2014,9(11):e112078.

DMOG promotes angiogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells

ZHU Meifei,JIANG Ronglin,LEI Shu,et al.Department of Critical Care Medicine,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310006,China

Objective To investigate the effect and mechanism of dimethyloxalyl glycine(DMOG)mediated on angiogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs). Methods MSCs were isolated from rat bone marrow and divided into five groups:normoxia solvent control group (N-DMSO),hypoxia solvent control group (H-DMSO),20μM DMOG treated group (D-20μM),100μM DMOG treated group(D-100μM)and 500μM DMOG treated group(D-500μM).The following indicators were observed:(1)MSCs were cultured with DMOG(20,100 and 500μM)under hypoxic condition.The growth inhibitory effect was observed by CCK-8 and the optimal dosage of DMOG was measured.(2)The angiogenic effect of MSCs was measured by Matrigel method.(3)The expression of angiogenesis related proteins were detected by Western blot. Results (1)Effect of DMOG on MSCs in different concentration groups：N-DMSO:3.25±0.05,H-DMSO:2.23±0.14,D-20μM:2.68±0.43,D-100μM: 3.11±0.25,D-500μM:3.23±0.04.As compared with N-DMSO group,H-DMSO group was significantly decreased(P＜0.01),As compared with H-DMSO group,the OD of D-20μM,D-100μM and D-500μM group were significantly increased(P＜0.05或0.01).(2)Effect of DMOG on normal MSCs in different concentration groups:D-20μM:3.19±0.02,D-100μM:3.15±0.06, D-500μM:2.51±0.08.As compared with N-DMSO group,D-500μM group was significantly decreased(P＜0.01),while D-20μM group,D-100μM group and N-DMSO group had no statistically significant difference(P＞0.05),suggesting that DMOG with 20μM and 100μM exert none cell toxicity.(3)Expression of angiogenesis related proteins:As compared with H-DMSO group, HIF-1α protein level was significantly increased in D-100μM group at 3,6 and 24h after hypoxia(1.44±0.32 vs.7.79±0.23;2.4±0.28 vs.3.51±0.79;0.93±0.37 vs.2.46±0.07,P＜0.05 or 0.01),pAKT protein level was significantly increased in D-100μM group at 6h after hypoxia(0.47±0.15 vs.0.71±0.03,P＜0.05),VEGF protein level was significantly increased in D-100μM group at 6 and 24h after hypoxia (0.63±0.10 vs.0.87±0.14;0.42±0.06 vs.0.70±0.06,P＜0.05 or 0.01),especially the 24h after hypoxia.While there was no significant difference between the two groups in protein expression of pmTOR/mTOR and pERK/ERK (P＞0.05 respectively). Conclusion DMOG inhibits the degradation of HIF-1α and promotes the phosphorylation of AKT to improve the angiogenesis of MSCs in hypoxic condition.

Bone marrow mesenchymalstem cells DMOG Angiogenesis Hypoxia

2016-04-11）

（本文編輯：馬雯娜）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生一般研究計劃（2013KYA142）；浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項目（2014-108）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)科研基金資助（2015ZY25）

310006 杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（朱美飛、江榮林、雷澍、王靈聰）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院（劉騫）

劉騫，E-mail：21019003@zju.edu.cn