經(jīng)尿道灌注干細胞白血病基因慢病毒轉(zhuǎn)染豚鼠糖尿病膀胱病變的效果研究

魏艷青，馬路平，王江平，錢 彪，王勤章

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·論著·

經(jīng)尿道灌注干細胞白血病基因慢病毒轉(zhuǎn)染豚鼠糖尿病膀胱病變的效果研究

魏艷青，馬路平，王江平，錢 彪，王勤章

目的 制備糖尿病膀胱病變(DCP)豚鼠模型，經(jīng)尿道灌注干細胞白血病(SCL)基因慢病毒，觀察其轉(zhuǎn)染效果及穩(wěn)定性。方法 2014年11月—2015年6月，采用隨機數(shù)字表法在75只普通級荷蘭種雄性豚鼠中選取60只單次腹腔注射鏈脲佐菌素(200 mg/kg)，常規(guī)飼養(yǎng)6周后按血糖水平>11.1 mmol/L篩選糖尿病模型，再常規(guī)飼養(yǎng)4周后通過尿流動力學檢測儀篩選DCP模型；另15只作為對照組，單次注射配制的鏈脲佐菌素緩沖液，飼養(yǎng)時間相同。采用隨機數(shù)字表法從成功造模的DCP模型中選取15只后，再采用隨機數(shù)字表法分為Ⅰ組(3只)和實驗組(12只)，Ⅰ組不予處理，實驗組經(jīng)尿道分2次灌注SCL基因慢病毒(1.6×107TU)，于2次灌注結(jié)束后第2、7、14、28天分別采用頸椎脫臼法處死實驗組豚鼠3只，記為Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組，Ⅰ組與Ⅱ組一同處死，取膀胱組織冷凍于液氮中，甘油封固后激光共聚焦顯微鏡下觀察組織中綠色熒光分布情況。采用qRT-PCR檢測SCL mRNA表達水平。結(jié)果 DCP模型造模過程中，糖尿病模型篩選時棄去18只，尿流動力學檢測儀篩選時棄去19只，最終得到DCP模型豚鼠23只，記為DCP模型組。DCP模型組豚鼠最大逼尿肌壓低于對照組，最大膀胱容量大于對照組(P<0.01)。Ⅰ組豚鼠膀胱組織未見綠色熒光分布，Ⅱ組豚鼠膀胱組織綠色熒光不明顯，Ⅲ組豚鼠膀胱組織可見全層遍布極強綠色熒光，Ⅳ組豚鼠膀胱組織可見全層強綠色熒光，Ⅴ組豚鼠膀胱組織仍可見綠色熒光存在。Ⅰ組豚鼠膀胱組織SCL mRNA表達水平為(1.00±0.00)，Ⅱ組豚鼠膀胱組織SCL mRNA表達水平是Ⅰ組的(1.22±0.06)倍，Ⅲ組豚鼠膀胱組織SCL mRNA表達水平是Ⅰ組的(50.45±3.17)倍，Ⅳ組豚鼠膀胱組織SCL mRNA表達水平是Ⅰ組的(24.75±6.49)倍，Ⅴ組豚鼠膀胱組織SCL mRNA表達水平是Ⅰ組的(3.27±1.00)倍。結(jié)論 SCL基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染豚鼠DCP膀胱成功，并能穩(wěn)定表達，有可能為DCP的臨床治療帶來新的研究方式。

糖尿病并發(fā)癥；膀胱疾病；慢病毒感染；干細胞白血病

魏艷青，馬路平，王江平，等.經(jīng)尿道灌注干細胞白血病基因慢病毒轉(zhuǎn)染豚鼠糖尿病膀胱病變的效果研究[J].中國全科醫(yī)學，2016，19(33)：4079-4082.[www.chinagp.net]

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糖尿病膀胱病變(DCP)是在糖尿病的基礎(chǔ)上發(fā)生的膀胱功能改變，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[1]。目前臨床上并無確切有效的特異性治療手段，本實驗通過膀胱灌注干細胞白血病(SCL)基因慢病毒轉(zhuǎn)染豚鼠膀胱組織，觀察其轉(zhuǎn)染效果及膀胱組織中SCL mRNA的表達情況，為進一步研究基因治療DCP奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

1.1.1 實驗動物 普通級荷蘭種雄性豚鼠75只，體質(zhì)量400～450 g，2月齡，購自新疆醫(yī)科大學動物實驗中心。

1.1.2 實驗材料 鏈脲佐菌素(北京索萊寶科技有限公司)，尿流動力學檢測儀(Laborie公司)，SCL基因慢病毒(上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司)，豚鼠用尿管由麻醉用硬膜外導管改良制成，冷凍切片(ICIROM325，德國)由石河子大學第一附屬醫(yī)院病理科協(xié)助完成，熒光觀察部分在石河子大學教育部重點實驗室激光共聚焦顯微鏡(Leica TCSSP5，德國)下完成，Trizol(Invitrogen)，高速離心機、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR儀PE7500 FAST(ABI 公司)。

1.2 方法

1.2.1 DCP模型制備 2014年11月—2015年6月，采用隨機數(shù)字表法在75只豚鼠中選取60只單次腹腔注射鏈脲佐菌素(200 mg/kg)，常規(guī)飼養(yǎng)6周后按血糖水平>11.1 mmol/L篩選糖尿病模型，不符合要求或死亡的豚鼠棄去；再常規(guī)飼養(yǎng)4周后通過尿流動力學檢測儀篩選DCP模型，不符合要求或死亡的豚鼠棄去。另15只作為對照組，單次注射配制的鏈脲佐菌素緩沖液，飼養(yǎng)時間相同，具體實驗方法及參數(shù)參考本課題組前期實驗內(nèi)容[2]。

1.2.2 經(jīng)尿道膀胱灌注SCL基因慢病毒 采用隨機數(shù)字表法從成功造模的DCP模型豚鼠中選取15只，再采用隨機數(shù)字表法分為Ⅰ組(3只)和實驗組(12只)，Ⅰ組不予處理，實驗組經(jīng)尿道分2次灌注SCL基因慢病毒(1.6×107TU)，第1天禁食水6 h后采用10%水合氯醛(200 mg/kg)溶液腹腔注射麻醉，插入尿管后采用0.9%氯化鈉溶液反復沖洗膀胱并排空，經(jīng)尿道膀胱灌注SCL基因慢病毒，結(jié)束后結(jié)扎尿管保留SCL基因慢病毒2 h，第3天進行第2次膀胱灌注(操作過程同第1天)。

1.2.3 鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果 實驗組于2次灌注結(jié)束后第2、7、14、28天分別采用頸椎脫臼法處死實驗組豚鼠3只，記為Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組，Ⅰ組與Ⅱ組一同處死，取膀胱組織冷凍于液氮中，2 h后冷凍切片(厚度7 μm)，甘油封固后激光共聚焦顯微鏡下觀察組織中綠色熒光分布情況。

1.2.4 RT-qPCR檢測SCL mRNA表達水平 切取部分膀胱組織，Trizol法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；由PCR儀PE7500 FAST完成SCL基因慢病毒及內(nèi)參基因β-actin的擴增，目的基因上游引物：5′-GCATGGTGCAGCTGAGTCCTC-3′，下游引物：5′-CAGGGTCCTTGCCAGTCTTGG-3′；反應(yīng)體系：cDNA 2 μl，上下游引物各0.5 μl，SYBR Green PCR Master Mix 10 μl；反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min激活DNA聚合酶；PCR條件為：95 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，共40 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。采用相對定量法(2-ΔΔCt法)進行計算。

2 結(jié)果

2.1 DCP模型豚鼠的制備 DCP模型豚鼠制備過程中，篩選糖尿病模型時棄去18只，尿流動力學檢測儀篩選棄去19只，最終得到DCP模型豚鼠23只，記為DCP模型組。DCP模型組豚鼠最大逼尿肌壓低于對照組，最大膀胱容量大于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見表1)。

表1 對照組與DCP模型組豚鼠最大逼尿肌壓和最大膀胱容量比較Table 1 Comparison of maximal detrusor pressure and maximum bladder capacity between control group and DCP model group

2.2 激光共聚焦顯微鏡下觀察DCP模型豚鼠膀胱組織轉(zhuǎn)染效果 Ⅰ組豚鼠膀胱組織未見綠色熒光分布，Ⅱ組豚鼠膀胱組織綠色熒光不明顯，Ⅲ組豚鼠膀胱組織可見全層遍布極強綠色熒光，Ⅳ組豚鼠膀胱組織可見全層強綠色熒光，Ⅴ組豚鼠膀胱組織仍可見綠色熒光存在(見圖1，本文圖1彩圖見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。

2.3 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組膀胱組織中SCL mRNA表達水平比較 Ⅰ組豚鼠膀胱組織SCL mRNA表達水平為(1.00±0.00)，Ⅱ組豚鼠膀胱組織SCL mRNA表達水平是Ⅰ組的(1.22±0.06)倍，Ⅲ組豚鼠膀胱組織SCL mRNA表達水平是Ⅰ組的(50.45±3.17)倍，Ⅳ組豚鼠膀胱組織SCL mRNA表達水平是Ⅰ組的(24.75±6.49)倍，Ⅴ組豚鼠膀胱組織SCL mRNA表達水平是Ⅰ組的(3.27±1.00)倍。

3 討論

目前全球范圍內(nèi)對DCP的發(fā)病機制并無明確的認識，多考慮與神經(jīng)、血管病變有關(guān)[1]。因其發(fā)病機制不明確，導致臨床對DCP的處理并無切實有效的手段。近年來部分學者對膀胱Cajal間質(zhì)細胞(interstitial cells of Cajal,ICC)的研究為DCP的發(fā)病機制研究找到了新的切入點[3]，同時也為其臨床治療帶來新方向。

近年研究發(fā)現(xiàn)，膀胱組織中存在一種ICC，其可能是膀胱的起搏細胞，可調(diào)控逼尿肌的收縮[4]。而高糖環(huán)境下膀胱組織ICC受損可能是導致DCP發(fā)病的原因之一[5]。進一步研究發(fā)現(xiàn)ICC細胞膜上的酪氨酸蛋白激酶受體(C-kit蛋白)具有維持ICC形態(tài)及功能的作用[6]，并且證實在高糖環(huán)境下C-kit及其mRNA低表達是導致ICC數(shù)量減少、形態(tài)及功能損害的主要原因[7-8]。如果恢復或提高高糖環(huán)境下C-kit表達，是否就能恢復膀胱ICC的功能，進而達到治療DCP的目的尚有待進一步研究。

SCL基因是C-kit基因表達過程中轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)一結(jié)合位點，通過作用于C-kit基因啟動子來調(diào)節(jié)C-kit表達，可明顯上調(diào)造血細胞及多種干細胞表達C-kit[9-11]；本課題組前期通過構(gòu)建SCL腺病毒介導SCL基因轉(zhuǎn)染體外高糖環(huán)境下培養(yǎng)的形態(tài)、功能受損的ICC，結(jié)果顯示，C-kit表達上調(diào)，ICC的形態(tài)和功能顯著改善[12]。而以HIV-1為基礎(chǔ)構(gòu)建的慢病毒載體具有可感染非分裂細胞、轉(zhuǎn)移基因片段容量較大、轉(zhuǎn)染所需的病毒滴度高、目的基因表達時間長、不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)等優(yōu)點[13]，因此目前被廣泛應(yīng)用于科研實驗，探索臨床疾病新的治療方法。

本實驗通過經(jīng)尿道膀胱灌注SCL基因慢病毒來介導SCL基因轉(zhuǎn)染DCP豚鼠膀胱，激光共聚焦顯微鏡下觀察其轉(zhuǎn)染效果，并通過RT-qPCR檢測SCL mRNA表達水平。經(jīng)過本課題組前期的預(yù)實驗，按照確定的能取得較好轉(zhuǎn)染效果的病毒量(1.6×107TU)進行膀胱灌注[14]，分別在灌注結(jié)束的第2、7、14、28天進行觀察，從熒光分布可見SCL基因慢病毒在灌注后第2天與對照組并無明顯區(qū)別，至第7、14天綠色熒光顯著增強，第28天綠色熒光仍持續(xù)存在，證明慢病毒轉(zhuǎn)染在時間上的穩(wěn)定性；從RT-qPCR結(jié)果可以得出，灌注結(jié)束第2天SCL mRNA表達水平是常規(guī)水平的(1.22±0.06)倍，灌注結(jié)束第7、14天SCL mRNA表達水平分別是常規(guī)水平的(50.45±3.17)倍、(24.75±6.49)倍，且直到灌注結(jié)束后第28天，其SCL mRNA仍處于較高表達水平；而由于樣本量的問題以及動物實驗過程中的不可控性，實驗中的RT-qPCR結(jié)果并不十分嚴謹，但其增高倍數(shù)與激光共聚焦顯微鏡下綠色熒光的分布趨勢基本相符，因此本研究初步估計：經(jīng)尿道灌注SCL基因慢病毒后，SCL水平在灌注初期隨時間逐漸增高，而后在某一時間點達到峰值后出現(xiàn)下降趨勢，但其過表達時間可長達近1個月，可見慢病毒可以介導SCL基因在轉(zhuǎn)染組織中穩(wěn)定持續(xù)表達。

圖1 DCP模型豚鼠膀胱組織激光共聚焦顯微鏡下綠色熒光分布情況(×200)

Figure 1 The distribution of green fluorescence under laser scanning confocal microscope in DCP model of guinea pig

綜上，本課題組前后通過體外及在體實驗相繼證實慢病毒可以成功介導SCL基因轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的膀胱ICC及豚鼠膀胱組織，并可實現(xiàn)SCL基因在體內(nèi)的穩(wěn)定持續(xù)表達，這將為進一步研究SCL基因慢病毒能否上調(diào)C-kit進而恢復DCP中受損的ICC形態(tài)和功能奠定了基礎(chǔ)，也為DCP的臨床特異性治療帶來了可能。

作者貢獻：魏艷青進行實驗設(shè)計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；馬路平在實驗過程中予以輔助工作；王江平對實驗進度及成果進行監(jiān)督，錢彪對實驗過程進行監(jiān)督，王勤章負責整體實驗的設(shè)計、過程指導、論文質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：毛亞敏)

Effect of SCL Lentivirus Transfection Through Perfusing Diabetic Cystopathy of Bladder in Guinea Pig Models

WEIYan-qing，MALu-ping，WANGJiang-ping，QIANBiao，WANGQin-zhang.DepartmentofPediatricSurgery,NanyangSecondPeople′sHospital，Nanyang473000,China

Correspondingauthor:WANGQin-zhang，DepartmentofUrology,theFirstAffiliatedHospitalofShiheziUniversity，Shihezi832000,China；E-mail:wqz1969@sina.com

Objective To prepare guinea pig model of diabetic cystopathy (DCP) of bladder and transurethrally perfuse stem cell leukemia (SCL) gene lentivirus in order to evaluate the transfection efficiency and stability.Methods From November 2014 to June 2015,a total of 60 guinea pigs were selected from 75 Holland male guinea pigs by random number table method and given streptozotocin(STZ) (200 mg/kg) by a single intraperitoneal injection.The models of diabetic were screened according to the blood glucose level>11.1 mmol/L after 6- week feeding.Then the models of DCP were screened by urodynamic testing after 4-week feeding.The left 15 guinea pigs were injected with the same dose of buffer STZ and fed in the same way(the control group).Fifteen guinea pigs were selected from the successful DCP models and divided into Ⅰ group (n=3) and experimental group (n=12) by random number table method.The Ⅰgroup was not treated,and the experimental group was transurethrally perfused with SCL lentivirus(1.6×107TU) twice.At the 2th,7th,14th,28th day after the second perfuse,3 guinea pigs were killed by cervical dislocation and marked as Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ and Ⅴ group,respectively.The Ⅰ group was killed at the same time with Ⅱ group.The bladder tissue was frozen in liquid nitrogen.The distribution of green fluorescence in the tissue was observed under laser confocal microscopy after glycerol sealing.The expression level of SCL mRNA was detected using qRT-PCR method.Results During the preparing the DCP model,18 guinea pigs were discarded in the diabetic model screening and 19 guinea pigs were discarded in the urodynamic testing,and finally 23 DCP models were obtained(DCP model group).The maximal detrusor pressure in DCP model group of guinea pigs was lower than control group,the maximum bladder capacity was larger than control group(P<0.01).There was no green fluorescence in the bladder tissue layer of Ⅰ group.The green fluorescence was not obvious in the bladder tissue layer of Ⅱ group.A super strong green fluorescence was observed throughout the whole bladder tissue layer in Ⅲgroup.There was strong green fluorescence in the whole bladder tissue layer of Ⅳgroup.There was still visible green fluorescence in the bladder tissue layer of Ⅴgroup.The expression of SCL mRNA in Ⅰ group was (1.00±0.00).The expression of SCL mRNA in Ⅱgroup was (1.22±0.06) times higher than Ⅰ group.The expression of SCL mRNA in Ⅲ group was (50.45±3.17) times higher than Ⅰ group.The expression of SCL mRNA in Ⅳgroup was (24.75±6.49) times higher than Ⅰ group.The expression of SCL mRNA in Ⅴ group was (3.27±1.00) times higher than Ⅰ group.Conclusion The lentiviral vector of SCL gene could successfully transfect into the DCP bladder of guinea pig and stably express,which might bring a new way for the clinical treatment of DCP.

Diabetes complications；Urinary bladder diseases；Lentivirus infections；Stem cell leukemia

國家自然科學基金資助項目(81360120)

473000河南省南陽市第二人民醫(yī)院小兒外科(魏艷青)；石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院泌尿外科(馬路平，王江平，錢彪，王勤章)

王勤章，832000新疆石河子市，石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院泌尿外科；E-mail:wqz1969@sina.com

R 587.2 R 694

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.33.011

2016-04-06；

2016-09-23)