金匱腎氣丸防治創傷后應激障礙綜合征孕鼠胎損的基因表達譜機制研究

王紅艷，張 輝，彭思涵，曹 俊，謝汶倚，張先庚

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·論著·

·中醫·中西醫結合研究·

金匱腎氣丸防治創傷后應激障礙綜合征孕鼠胎損的基因表達譜機制研究

王紅艷，張 輝，彭思涵，曹 俊，謝汶倚，張先庚

背景 孕期應激所致胎損與先天受損所致的腎氣受損密切相關，而金匱腎氣丸補腎后可改善母代孕期創傷后應激障礙綜合征(PTSD)所損之腎氣，改善母代PTSD導致的子代生長發育異常。目的 研究金匱腎氣丸防治PTSD孕鼠所致胎損的基因表達譜機制。方法 2014年7月—2015年3月，將首次受孕的36只SD孕鼠按照隨機數字表法分為空白對照組、PTSD組、中藥組，每組12只。PTSD組和中藥組大鼠于孕中期(妊娠第7～13天)進行PTSD造模。空白組和PTSD組正常實驗條件下常規飼料喂養，中藥組造模同時予以金匱腎氣丸飼料至分娩。采用表達譜芯片檢測30日齡子鼠的基因表達情況。結果 PTSD組與空白對照組子鼠基因表達譜分析顯示，共有112條基因差異表達，其中高表達70條，低表達42條。金匱腎氣丸可使得其中的53條差異表達基因恢復正常，這53條基因主要參與胞吞通路與絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路。結論 金匱腎氣丸防治孕鼠PTSD胎損的分子生物學機制與53條基因的差異表達有關，主要涉及胞吞通路與MAPK信號通路。

金匱腎氣丸；創傷后應激障礙綜合征；基因表達譜；MAPK信號通路；細胞內吞

王紅艷，張輝，彭思涵，等.金匱腎氣丸防治創傷后應激障礙綜合征孕鼠胎損的基因表達譜機制研究[J].中國全科醫學，2016，19(33)：4087-4091.[www.chinagp.net]

WANG H Y,ZHANG H,PENG S H,et al.Applying Jinkui Shengqi pills in pegnant rats with PTSD to treat fetal rats injury:gene expression profile and mechanism[J].Chinese General Practice，2016，19(33)：4087-4091.

創傷后應激障礙綜合征(PTSD)是指患者遭受重大壓力后心理狀態失調產生的后遺癥，這些壓力包括嚴重物理性傷害、身體或心理上的脅迫、生命遭到威脅等。PTSD作為一種精神創傷性事件后高發且后果嚴重的精神疾病，其發病率高達7%～12%[1-2]。而孕婦是最容易遭受PTSD損害的人群之一，易導致多種新生兒缺陷[3]。遺傳因素在PTSD的發生、行為遺傳與神經生物學改變中扮演著關鍵角色，也是“恐傷腎”、“腎主生長發育”等經典論述的具體體現[4-5]。本課題組前期研究表明，孕期應激所致胎損與先天受損所致腎氣受損密切相關，而金匱腎氣丸補腎后可改善母代孕期PTSD所損之腎氣，改善母代PTSD導致的子代生長發育異常[6-7]。為進一步研究金匱腎氣丸防治胎損的內在基因表達譜機制，特設計了此對照試驗，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 實驗時間為2014 年7 月—2015 年3月。購入SPF 級成年SD大鼠〔雌雄比為40∶36，成都達碩生物科技有限公司，生產合格證號：SCXK(川)2008-24〕。適應性喂養后合籠交配，以觀察到陰栓為成功受孕標志，選取初次受孕體質量為270～310 g的SD雌性大鼠36只，采用隨機數字表法分為：空白對照組、PTSD組、中藥組，每組12只，每組各3籠。空白對照組、PTSD組、中藥組孕鼠初孕體質量分別為(294.6±15.1)、(295.8±12.6)、(297.0±11.5)g，3組比較，差異無統計學意義(F=0.100，P=0.905)。

1.2 實驗造模 (1)空白對照組大鼠于正常實驗條件下常規飼料飼養，室溫20～22 ℃，相對濕度40%～60%，燈光12 h黑白交替照射，不給予任何干預措施。(2)PTSD組和中藥組大鼠于孕中期(妊娠第7～13天)采用國際通行的單程長時應激(SPS)法進行PTSD造模[8]。處理步驟如下：大鼠禁錮2 h后立即強迫游泳20 min(水深40 cm，水溫25 ℃)。(3)PTSD組大鼠于正常實驗條件下常規飼料喂養，造模同時予以金匱腎氣丸(北京同仁堂，研粉，0.5～0.6 g/d)飼料喂養[6]。所有大鼠在預產期前2天(妊娠第17天)進行分籠單獨飼養，以便記錄和測量。

1.3 試驗儀器與試劑 標準大鼠盒12套(60 cm×60 cm×60 cm)，為塑料邊框。盒底和盒蓋為不銹鋼絲網，盒下有塑料托盤。表達譜芯片測試、RT-PCR測試儀器與試劑見參考文獻[6]。

1.4 表達譜芯片試驗 空白對照組產子鼠161只，PTSD組產子鼠135只，中藥組產子鼠158只。子鼠出生第30天，各組采用隨機數字表法選取10只子鼠。取每只子鼠股動脈血4 ml，抗凝,分離白細胞后提取RNA，經質檢合格后，采用上海伯豪生物技術有限公司Agilent大鼠全基因4×44K芯片(ID：014879)。按照文獻[6]進行表達譜芯片實驗。

1.5 RT-PCR驗證 基因篩選原則：在配對比較中，設定芯片flag值不為A，倍差>2，表達值>6，結合GO，選取擬進行RT-PCR驗證的候選基因[6]。

2 結果

2.1 基因表達譜 分析PTSD組與空白對照組子鼠基因表達譜，以P<0.05且倍差>2、flag=P基因為篩選標準，共篩選出112條差異表達基因，其中高表達70條,低表達42條。分析中藥組與空白對照組子鼠基因表達譜，以P>0.05為條件，共篩選出37 984條無差異表達基因。

將PTSD組與空白對照組差異表達基因和中藥組與空白對照組無差異表達基因聯合分析，共篩選出53條基因，即PTSD組與空白對照組差異表達基因中高表達的32條基因和低表達的21條基因經中藥干預后恢復至正常水平，即在中藥組與空白對照組無差異表達(見表1)。

表1 中藥干預后表達正常的53條差異表達基因Table 1 53 differentially expressed genes returned to normal expression after treatment of Chinese traditional medicine

2.2 功能注釋 將53條差異表達基因導入KEGG數據庫(http://www.kegg.jp/)檢索，以P<0.05,q<0.05,Enrichment TestP值<0.05、Hits=3 為篩選標準，共篩選出2條差異表達KEGG通路，分別為胞吞通路(Hspa1l、Epn3、Folr1通路)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路(Ntf3、Fgf17、Hspa1l、Pla2g5通路)(見圖1、圖2)[9-10]。由以上2個KEGG通路圖可知，表達譜芯片所檢測出的差異表達基因從多方面參與了通路的調控。

2.3 RT-PCR驗證 設定芯片flag值不為A，倍差>2，表達值>6，結合GO與KEGG數據庫功能注釋，選取4條基因進行驗證，分別為 Aqp1、Glycam1、Steap1、Ace。4條基因的堿基序列見表2。如圖3所示，當RT-PCR結果中的2-AverageΔCt的值為>1時表示PTSD組所選基因的RNA濃度大于空白對照組，即PTSD組較空白對照組高表達，FC>2 表示PTSD組較空白對照組高表達，基因表達結果與RT-PCR驗證結果相符，符合率達100%，說明基因芯片可靠度較高。

3 討論

3.1 金匱腎氣丸防治PTSD的理論依據 中醫認為PTSD發生的主要病機為肝氣郁結與腎陽不足[11-12]，因此溫補腎陽當作為治療PTSD 的重要方法[6]。腎陽是全身陽氣的根本，對心陽起著溫煦和推動的作用，故扶助腎陽、補益元氣是臨床治療的重點，溫腎陽、益天元可助心陽，通心氣，復神明，恢復正常的心理功能[11]。腎中精氣與腦功能的關系主要表現為腦功能的物質基礎——腦髓化生來源于腎中精氣。腎精化生腦髓，成為生命之神的物質基礎。腎藏精而生髓，主攝納，主恐，倘若腎陽虛衰，化氣失司，精不上奉養髓，腦失所養，神識失常，或不能收攝精神，則可表現為恐懼、絕望、焦慮、抑郁等情緒失常，這些表現均符合 PTSD 的臨床診斷標準。說明溫陽為PTSD的基本治療原則，為助陽法的應用提供了理論支持，也為本研究選用金匱腎氣丸干預提供了理論支持。

3.2 金匱腎氣丸對PTSD子鼠基因表達譜的影響 金匱腎氣丸防治孕鼠PTSD對子鼠的損害具有多方面作用，有研究顯示，金匱腎氣丸可改善母代PTSD所致子代行為與神經系統發育遲緩，其內在機制可能與表達譜改變有關[4]。本研究顯示，PTSD可導致子鼠的53條基因表達異常，而經中藥干預后，中藥組子鼠的這些基因可恢復至正常水平。通過KEGG通路注釋，共篩選出2條主要KEGG通路，分別為胞吞通路、MAPK信號通路，提示差異表達基因參與了通路調控的多個方面。

注：A為Hspa1l通路，B為Epn3通路，C為Folr1通路

圖1 胞吞通路圖

Figure 1 Endocytosis pathway diagram

注：A為Ntf3通路，B為Fgf17通路，C為Hspa1l通路，D為Pla2g5通路

圖2 MAPK信號通路圖

Figure 2 MAPK signal pathway diagram

表2 4條驗證基因的堿基序列Table 2 Nucleotide sequences of the four validation genes

3.3 胞吞通路、MAPK信號通路與PTSD的關系 胞吞作用是通過質膜的變形運動將細胞外物質轉運入細胞內的過程，是生物物質與信息傳遞的基本形式。PTSD的應激過程與各種神經遞質的內吞傳遞密切相關[12]。LIN等[13]發現杏仁核的GABAA內吞與PTSD的恐懼重現有關。BAI等[14]發現d-serine可通過促進GluA2-containing AMPA受體的內吞作用來增強PTSD的恐懼消除。MAPK是一組可被各種胞外刺激，如神經遞質、細胞因子、細胞應激、激素及細胞黏附等激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。MAPK通路的三級激酶模式即MAPK激酶激酶、MAPK激酶和MAPK能依次激活，從而共同調控細胞的生長、分化、對環境的應激適應、炎性反應等多種重要的細胞生理/病理過程[15]。MAPK通路與PTSD密切相關，于健等[16]研究發現海馬和杏仁核的突觸可塑性及杏仁核MAPK磷酸化水平的降低可能是造成PTSD患者出現眾多精神癥狀的原因。有研究表明ERK-MAPK與p38 MAPk均參與了PTSD的應激過程，以及HPA軸的調控[17-18]。

圖3 PTSD組與空白對照組基因表達譜與RT-PCR驗證關聯分析

Figure 3 Analysis of correlation between gene expression profile and RT-PCR validation among PTSD group and blank control group

綜上，本研究從表達譜層面證實金匱腎氣丸防治孕鼠PTSD胎損的分子生物學機制與基因表達譜改變有關，即涉及MAPK信號通路、胞吞通路的表達譜改變的生物節律為主要通路。雖然基因芯片具有高通量、高效的特點，但也存在某些不足之處。例如實驗重復性欠佳、假陽性率偏高。本研究盡可能降低芯片本身因素對實驗的干擾，如設置了一定的生物學重復，但要完全消除這些誤差因素是不可能的。這有待于下一代擴大生物學重復以及新的測序技術發展來有效地結局芯片本身帶來誤差等問題。

作者貢獻:王紅艷、張輝進行實驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責;彭思涵、曹俊、謝汶倚進行實驗實施、評估、資料收集;張先庚進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：趙躍翠)

Applying Jinkui Shengqi Pills in Pregnant Rats with PTSD to Treat Fetal Rats Injury:Gene Expression Profile and Mechanism

WANGHong-yan,ZHANGHui,PENGSi-han,CAOJun，XIEWen-yi，ZHANGXian-geng.SichuanNursingVocationalCollege,Chengdu610100,China

Correspondingauthor:ZHANGHui，ChengduUniversityofTCM，Chengdu611137，China；E-mail：jeff_chuang@foxmail.com

Background The prenatal stress can cause fetal rats injury,it is closely related to congenital impairment-induced kidney qi damage.Jinkui Shengqi Pills can improve the kidney qi damage of pregnant rats with post traumatic stress disorder(PTSD),and can improve the pregnant rats′ PTSD-induced abnormal growth of offspring rats.Objective Jinkui Shengqi Pills were applied in pregnant rats with PTSD to treat fetal rats injury,the gene expression profile and mechanism were explored.Methods The study was implemented between July 2014 and March 2015,36 initial pregnant SD rats were divided into 3 groups by random number table method:control group(n=12),PTSD group(n=12),and Jinkui Shengqi Pill group(n=12).The PTSD model rats were established during the second trimester(the 7th-13th day after gestation) in PTSD group and Jinkui Shengqi Pill group.The rats in control group and PTSD group were fed with conventional food under normal experiment condition.The rats in Jinkui Shengqi Pill group were fed with food consisting of Jinkui Shengqi Pill until delivery.Gene expression of 30 days old rats was detected by gene expression profile chips.Results According to the gene expression profile analysis of 30 days old rats in PTSD group and blank group,there were 112 differentially expressed genes,including 70 highly expressed genes and 42 low expressed genes,among which 53 genes returned to normal by using Jinkui Shengqi Pills,these 53 genes were mainly involved in endocytosis pathway and MAPK signaling pathway.Conclusion Applying Jinkui Shengqi Pills in pregnant rats with PTSD can treat fetal rats injury,the underlying molecular biology mechanism is related to the differential expression of 53 genes,these 53 genes were mainly involved in endocytosis pathway and MAPK signaling pathway.

Jinkui Shengqi pills;Post traumatic stress disorder;Gene expression profiling;MAPK signaling pathway;Endocytosis pathway

國家自然科學基金資助項目(81373710)；成都中醫藥大學科技發展基金項目(ZRQN1541)

610100四川省成都市，四川護理職業學院(王紅艷，張先庚)；成都中醫藥大學(張輝，彭思涵，曹俊，謝汶倚)

張輝，611137四川省成都市，成都中醫藥大學；E-mail：jeff_chuang@foxmail.com

R 749.72

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.33.013

2016-03-15；

2016-09-25)