流式細胞儀氣動穩(wěn)流聚焦系統(tǒng)設計與測試

嚴心濤， 鐘金鳳， 吳云良， 王 策， 武曉東

(中國科學院 蘇州生物醫(yī)學工程技術(shù)研究所，江蘇 蘇州 215163)

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流式細胞儀氣動穩(wěn)流聚焦系統(tǒng)設計與測試

嚴心濤， 鐘金鳳， 吳云良， 王 策， 武曉東

(中國科學院 蘇州生物醫(yī)學工程技術(shù)研究所，江蘇 蘇州 215163)

基于氣動穩(wěn)流方法，研制了一種流式細胞儀三維液流聚焦的液流系統(tǒng)。通過大量的實驗數(shù)據(jù)，分析了所搭建系統(tǒng)的鞘液流量與氣動裝置中氣壓之間的關(guān)系，得出了細長孔動態(tài)流動的流量經(jīng)驗公式適用于所搭建的系統(tǒng)。利用CCD熒光成像方法對系統(tǒng)的樣品聚焦穩(wěn)定性進行了定性測試。使用Matlab軟件對APD探測的多組樣品聚焦的熒光信號進行了計算和分析，定量地評定了系統(tǒng)的樣品聚焦穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，研制的液流系統(tǒng)的樣品聚焦寬度14 μm時，脈動低于0.5 μm；聚焦樣品流的熒光信號的波動方差低于0.606。

流式細胞儀； 穩(wěn)流； 聚焦； 氣動

0 引 言

流式細胞儀是生命科學研究領(lǐng)域中先進的儀器之一，是一種可以快速、準確、客觀，并且能夠同時檢測快速直線流動狀態(tài)中的單個微粒(0.2～100 μm)的多項物理及生物學特性，用以分析定量也可對特定群體加以分選的儀器，廣泛應用于免疫學、細胞學、海洋微生物學、藥物代謝檢測以及臨床醫(yī)學檢驗等方面[1-5]。

目前，實現(xiàn)單個微?？焖僦本€聚焦的方法主要有傳統(tǒng)的三維鞘液動力學聚焦、微流管毛細作用聚焦[6]、超聲波聚焦[7-8]、慣性流體聚焦[9]以及芯片上的液流聚焦[10-11]等。其中，三維鞘液動力學聚焦方法實現(xiàn)單個微粒的聚焦檢測速度最快，但此方法對微粒聚焦位置和流動速度的穩(wěn)定性提出很高的要求，而鞘液對微粒聚焦位置和流動速度的穩(wěn)定性又起著關(guān)鍵性作用[1,12]。為實現(xiàn)鞘液對微粒穩(wěn)定地聚焦，現(xiàn)采用的手段主要有注射泵控制鞘液的傳輸[13]，因注射泵每次傳輸?shù)牧髁坑邢?，該方法難以實現(xiàn)樣品長時間高速檢測；蠕動泵傳輸鞘液，并在管路中加入多種穩(wěn)流裝置[14]，該方法對穩(wěn)流裝置的設計制作的要求較高；利用氣動裝置實現(xiàn)鞘液的穩(wěn)定流動，來實現(xiàn)微粒檢測的穩(wěn)定性[15]，該專利控制鞘液穩(wěn)流的氣動裝置比較復雜。

本文基于這種氣動穩(wěn)流方法，在該專利的基礎上研制出一種簡易的氣動-液流系統(tǒng)；通過大量實驗數(shù)據(jù)與經(jīng)驗公式計算結(jié)果的比較，評估了鞘液流量與氣動裝置中的氣壓大小關(guān)系，并以此為滿足所需要的鞘液流量，反算出氣動裝置所需要的控制氣壓大小；研究了該氣動穩(wěn)流系統(tǒng)的樣品聚焦穩(wěn)定性的定性和定量的測試方法。

1 氣動穩(wěn)流聚焦系統(tǒng)原理

本系統(tǒng)的工作原理簡圖如圖1所示，鞘液通過水泵(電磁泵或隔膜泵等)抽取，并經(jīng)鞘液入口11流入到儲氣罐12中；之后鞘液在儲氣罐12的控制壓力p0下經(jīng)節(jié)流孔接頭8穩(wěn)定地流入流動室2中；其中，儲氣罐12中的氣壓由精密氣壓調(diào)節(jié)閥9控制；樣品由樣品泵4抽取，再經(jīng)樣品針管3進入流動室2中；根據(jù)液流動力學聚焦原理，進入流動室2中的樣品在鞘液作用下聚焦，之后經(jīng)混合液出口流出。

圖1 氣動穩(wěn)流聚焦系統(tǒng)原理簡圖

2 氣動穩(wěn)流系統(tǒng)壓力與流量關(guān)系

2.1 氣動穩(wěn)流聚焦系統(tǒng)搭建

為分析本系統(tǒng)儲氣罐中控制壓力值與鞘液流量間的關(guān)系，搭建的系統(tǒng)采用Air Control公司的精密氣壓調(diào)節(jié)閥，其輸出氣壓的控制精度±344 Pa，利用該調(diào)節(jié)閥來維持儲氣罐中的恒壓狀態(tài)；采用西安儀表廠的精密壓力表，其量程160 kPa，精度等級0.25級，用于測試本系統(tǒng)管路中的壓力值；水泵可采用隔膜泵；流動室鞘液入口位置比節(jié)流孔鞘液出口位置的高度約高10 cm；采用的節(jié)流孔接頭的長度l1=10 mm，直徑d1=230 μm；流動室節(jié)流孔的截面是一正方形，其邊長a=250 μm，節(jié)流孔的長度l2=11.6 mm，流動室的水力直徑d2與a之間的關(guān)系為：

d2=4Rh, Rh=A/P

(1)

式中:A為液流流過流動室節(jié)流孔的橫截面積;P為流動室節(jié)流孔的濕周周長,則流動室節(jié)流孔的水力直徑d2為250 μm；流路中的其他管子直徑d3為3 mm。

2.2 系統(tǒng)控制壓力與流量關(guān)系實驗

為了分析系統(tǒng)控制壓力與流量關(guān)系，在不同控制壓力下，測試節(jié)流孔接頭前后的壓力值p11和p12，鞘液在流動室中聚焦前后的壓力值p21和p22，以及混合液塞滿(100±0.05)mL量瓶時間t。其中，在不同控制壓力下，鞘液的流量Q見表1。表1中也顯示出系統(tǒng)在不同控制壓力下，兩組測試實驗的流量誤差δ均在1%以下，說明鞘液流動的穩(wěn)定性很好。

本系統(tǒng)采用的節(jié)流孔接頭和流動室節(jié)流孔均是細長孔，其流量Q與其前后的壓力差Δp之間的經(jīng)驗公式為：

Δp=128μlQ/(πd2)

(2)

其中:μ為液流的黏度；l為細長孔的長度;d為細長孔的直徑；鞘液為去離子純凈水，其黏度μ約0.001 N·s·m-2。根據(jù)式(2)不難計算出節(jié)流孔接頭和流動室聚焦前后壓力差，以及與實驗測得的壓力差的誤差大小。表2和表3顯示在不同控制壓力下，系統(tǒng)中2個節(jié)流孔的壓力差的測量值與經(jīng)驗公式計算值的誤差均在10%以內(nèi)，引起壓力誤差的原因除了經(jīng)驗公式與實際管路模型存在一些偏差外，還由精密壓力表的測量精度(測量精度為±400 Pa)和精密氣壓調(diào)節(jié)閥的穩(wěn)

表2 節(jié)流孔接頭前后測量的壓力差與細長孔動態(tài)流動的流量經(jīng)驗公式計算的壓力差

表3 流動室聚焦前后測量的壓力差與細長孔動態(tài)流動的流量經(jīng)驗公式計算的壓力差

壓精度(控制精度為±344 Pa)引起；在該誤差范圍內(nèi)，本系統(tǒng)的節(jié)流孔前后的壓力差可由經(jīng)驗公式進行初步評估；若再結(jié)合液流連續(xù)方程：

(3)

以及伯努利定理：

(4)

就可以通過系統(tǒng)所需要的鞘液流量大小，計算出儲氣罐中所需要控制的氣壓大小。其中:D為管道的直徑;z為測量點的相對高度;ρ為鞘液的密度;v為流速，p為壓力大小。

3 系統(tǒng)樣品聚焦穩(wěn)定性測試

3.1 基于CCD成像的樣品聚焦穩(wěn)定性定性測試

在該測試方法中，所測試的樣品采用稀釋的羅丹明，其在532 nm激光器下可激發(fā)出強烈的熒光；為了降低CCD成像的背景噪聲，在顯微物鏡前安裝一高通濾波片，用于濾除流動室上的散射激光；調(diào)節(jié)反射鏡，使得激光照射在樣品聚焦的位置上；羅丹明受激激發(fā)的熒光經(jīng)過一高通濾波片和顯微物鏡后即可在CCD上成像，并通過數(shù)據(jù)線上傳到顯示屏上，實時顯示樣品聚焦的狀態(tài)，其測試原理如圖2所示。

圖2 CCD成像的樣品聚焦穩(wěn)定性測試方法原理圖

為了定性地測試氣動穩(wěn)流系統(tǒng)的穩(wěn)定性，將其與不含儲氣罐的液流系統(tǒng)(其他條件都一樣)作對比；同時，為了排除樣品流自身脈動的影響，采用低脈動的流量穩(wěn)定的注射泵抽取樣品，其中，注射泵的針管容量為50 μL，流量設定20 μL/min。在顯示屏可觀測到，經(jīng)隔膜泵直接抽取的鞘液對樣品聚焦時，樣品流的聚焦寬度為12～16 μm之間周期性脈動，其中，脈動的周期與隔膜泵的運動周期一致；氣動穩(wěn)流系統(tǒng)的樣品流的聚焦寬度為14 μm，脈動在0.5 μm以內(nèi)。通過該CCD成像方法，可以直觀、定性地觀測到本氣動穩(wěn)流系統(tǒng)的樣品聚焦穩(wěn)定性還是很好的。

3.2 基于APD熒光探測的樣品聚焦穩(wěn)定性定量測試

在該測試的方法中，所測試的樣品仍采用羅丹明，其在532 nm激光器下所激發(fā)的熒光經(jīng)兩個透鏡聚焦后匯聚到APD上；為了提高信噪比，在APD前裝配一高通濾波片和一帶通濾波片；APD探測的熒光信號上傳到示波器上；之后，再將示波器存儲的數(shù)據(jù)導入到Matlab軟件中，經(jīng)數(shù)據(jù)提取，輸出脈動圖像以及作進一步地數(shù)據(jù)分析，其測試原理如圖3所示。

圖3 基于APD熒光探測的樣品聚焦穩(wěn)定性定量測試方法原理圖

同樣，為測試氣動穩(wěn)流系統(tǒng)的穩(wěn)定性，將其與不含儲氣罐的液流系統(tǒng)(其他條件都一樣)作對比；采用低脈動的流量穩(wěn)定的注射泵抽取樣品，以盡量排除樣品流自身脈動的影響，其中，注射泵的針管容量為50 μL。本方法采用樣品公差這一統(tǒng)計值對樣品流的聚焦穩(wěn)定性作定量地評定：

(5)

圖4 在注射泵流量為20 μL/min下，氣壓穩(wěn)流系統(tǒng)的聚焦樣品流熒光信號波動圖

圖5 在注射泵流量為20 μL/min下，隔膜泵直接抽取鞘液的聚焦樣品流熒光信號波動圖

圖6 在注射泵流量為40 μL/min下，氣壓穩(wěn)流系統(tǒng)的聚焦樣品流熒光信號波動圖

在Matlab中利用式(5)計算熒光信號的波動方差。其中，在注射泵流量為20 μL/min下，氣壓穩(wěn)流系統(tǒng)的聚焦樣品流熒光信號的波動方差為0.606，隔膜泵直接抽取鞘液下聚焦樣品流的熒光信號的波動方差為2.592；在注射泵流量為40 μL/min下，氣壓穩(wěn)流系統(tǒng)的聚焦樣品流熒光信號的波動方差為0.521，隔膜泵直接抽取鞘液下聚焦樣品流的熒光信號的波動方差為5.534。通過上述實驗，可以定量地評定本文研制的氣壓穩(wěn)流系統(tǒng)的樣品聚焦穩(wěn)定性。

圖7 在注射泵流量為40 μL/min下，隔膜泵直接抽取鞘液的聚焦樣品流熒光信號波動圖

4 結(jié) 語

基于鞘液三維動力學聚焦原理，本文研制了一種簡易的氣動穩(wěn)流裝置，通過精密控制該裝置的氣壓可實現(xiàn)鞘液的穩(wěn)定流動，以此來滿足流式細胞儀樣品中微粒的高速穩(wěn)定的聚焦和檢測，并進行了大量的實驗和測試，可以得出以下結(jié)論：

本系統(tǒng)中節(jié)流孔前后的壓力差的實際測量值與經(jīng)驗公式計算的理論值偏差在10%以內(nèi)，可以采用經(jīng)驗公式估算本系統(tǒng)的節(jié)流孔前后的壓力差，再結(jié)合液流連續(xù)方程和伯努利定理，就可以根據(jù)系統(tǒng)所需的鞘液流量大小來反算出氣動裝置所需要精密控制的氣壓大??；通過本文提出的CCD成像測試方法，可以直觀定性地觀測到本系統(tǒng)的樣品聚焦穩(wěn)定性非常好；利用本文提出的APD熒光探測測試方法，可以定量地比較本氣動穩(wěn)流系統(tǒng)與不含儲氣罐的液流系統(tǒng)(其他條件都一樣)的穩(wěn)定性大小，結(jié)果顯示出本系統(tǒng)的樣品脈動比后者要小的多。

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Design and Test of Flow Cytometer Focusing System Based on Pneumatic Steady Flow Method

YANXin-tao，ZHONGJin-feng，WUYun-liang，WANGCe，WUXiao-dong

(Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology, Chinese Academy of Sciences, Suzhou 215163, China)

A three-dimensional (3-D) hydrodynamic focusing system was designed based on pneumatic steady flow method in flow cytometer. Through a large number of experimental data collected from the building platform, the relationship between the sheath flow rate and the pressure which in the pneumatic devices was analyzed, and the empirical traffic formula of dynamic flow in the elongated hole was gotten, and the formula could be applicable to build platform. The fluorescence imaging method was used to take charge-coupled device (CCD), qualitatively, the stability of the focusing sample in the system was tested. Using Matlab software, fluorescence signals of the focusing sample which detected by Avalanche Photo Diode (APD) were calculated and analyzed. The stability of the focusing sample were quantitatively evaluated. The results showed that the sample pulsating size of the flow system developed was below 0.5 μm. When the focus width of the sample was 14 μm; the fluctuation variance of the focused sample stream’s fluorescence signal was lower than 0.606.

flow cytometer; steady flow; focusing; pneumatic

2015-03-07

國家高技術(shù)研究發(fā)展(863)計劃資助項目(2011AA02A106)；蘇州市醫(yī)療器械與新醫(yī)藥專項(ZXY201428)

嚴心濤(1987-)，男，湖北仙桃人，助理研究員，從事機電液一體化研究。Tel.:0512-69588273；E-mail: yanxt@sibet.ac.cn

武曉東(1968-)，男，吉林舒蘭人,研究員，從事光學工程和醫(yī)用光學方面研究。E-mail：wuxiaodong2000@hotmail.com

TH 776

A

1006-7167(2016)01-0039-04