細(xì)胞培養(yǎng)在生物制藥領(lǐng)域的應(yīng)用

姜萌++季曉宇++羅來鵬++侯毅鞠

【摘 要】經(jīng)過長時間的研究與實踐，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)得到了充分的發(fā)展與完善，離體培養(yǎng)的動物細(xì)胞具有可以人為控制的培養(yǎng)條件且結(jié)果便于觀察的特點，因而被廣泛應(yīng)用于生物制藥領(lǐng)域中并對該領(lǐng)域產(chǎn)生了巨大而深遠(yuǎn)的影響。本文對細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在疫苗生產(chǎn)、單克隆抗體制備、藥物篩選、基因重組產(chǎn)品等生物制藥領(lǐng)域的應(yīng)用作一綜述。

【關(guān)鍵詞】細(xì)胞培養(yǎng) 生物制藥 應(yīng)用

隨著生命科學(xué)理論和技術(shù)的飛速發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的地位和作用日益成熟，動物細(xì)胞培養(yǎng)的研究取得了可觀的效果，并且有著無限的應(yīng)用發(fā)展前景。主要的發(fā)展目標(biāo)包括：開發(fā)生長密度高、目標(biāo)產(chǎn)品分泌量大的細(xì)胞系；研制性能優(yōu)良、吸附與解離容易、重復(fù)利用的微載體；開展規(guī)模化的生物反應(yīng)器、檢測系統(tǒng)、細(xì)胞培養(yǎng)與產(chǎn)物分離耦合系統(tǒng)等；設(shè)計新型培養(yǎng)基促進(jìn)生物制品安全；研究三維細(xì)胞的培養(yǎng)條件[1]。

生物制藥即運用生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)等原理和方法，利用生物機(jī)體、組織、細(xì)胞、體液等生產(chǎn)具有預(yù)防、診斷和治療功能的藥物制品。有關(guān)研究者采用基因重組技術(shù)或其他創(chuàng)新生物技術(shù)生產(chǎn)治療性藥物，主要產(chǎn)品有基因工程藥物、抗體工程藥物、疫苗等幾類。這些產(chǎn)品的開發(fā)研制及生產(chǎn)過程都離不開細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。

1 疫苗生產(chǎn)

疫苗免疫是最有效的預(yù)防感染性疾病的措施之一。疫苗免疫是指利用病毒性制劑、細(xì)菌性制劑及類毒素等人工主動免疫制劑，通過作用于機(jī)體的免疫防御系統(tǒng)起到免疫應(yīng)答作用。傳統(tǒng)的流感疫苗生產(chǎn)多采用雞胚培養(yǎng)，但當(dāng)面臨高致病性流感全球大流行、微生物感染、內(nèi)毒素殘余量多等問題時，傳統(tǒng)的雞胚生產(chǎn)方法可能難以滿足疫苗市場的需求。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的完善及其優(yōu)點的體現(xiàn)積極推進(jìn)使用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)替代雞胚培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)流感疫苗，未來將會越來越多依靠細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)獲得理想的疫苗。與此同時也存在一些缺陷，尤其是哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的病毒疫苗特別適合于工業(yè)的發(fā)展，應(yīng)用微載體大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗，使得流感病毒適應(yīng)傳代細(xì)胞（如VERO細(xì)胞），該細(xì)胞不僅培養(yǎng)條件要求不高而且遺傳性狀穩(wěn)定，對多種病毒的感染敏感[2]，如利用生物反應(yīng)器大規(guī)模進(jìn)行病毒繁殖，可實現(xiàn)流感疫苗的規(guī)模化生產(chǎn)。MDCK細(xì)胞系是被公認(rèn)為最適于生產(chǎn)甲、乙型流感病毒疫苗的細(xì)胞系，對流感病毒增殖快、感染效率高，且不易變異[3]。其中典型代表，如巴斯德公司利用1000L反應(yīng)器微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞生產(chǎn)人用狂犬病疫苗和脊髓灰質(zhì)炎疫苗。由此可見，利用細(xì)胞培養(yǎng)疫苗已成為目前疫苗研制的重要應(yīng)用方向。

2 單克隆抗體制備

單克隆抗體是由單一B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體。研究Hb在帕金森病中的發(fā)病機(jī)制，李旭穎等[4]制備抗Hb單克隆抗體，由重組人Hb作為抗原免疫小鼠，并將其細(xì)胞融合及細(xì)胞培養(yǎng)制備成雜交瘤，經(jīng)過篩選獲得抗人Hb單克隆抗體雜交瘤株，體內(nèi)誘生法制備腹水經(jīng)過酶聯(lián)免疫吸附試驗等方法進(jìn)而獲得特異性抗Hb單克隆抗體。張培等[5]制備乙型腦炎病毒的單克隆抗體通過動物免疫、細(xì)胞融合、克隆和篩選等方法，應(yīng)用ELISA等免疫學(xué)方法進(jìn)行特異性和亞型的鑒定，為快速檢測方法的建立奠定了基礎(chǔ)。單克隆抗體藥物研發(fā)已經(jīng)被列入863計劃和國家重點項目，國內(nèi)已經(jīng)有2個治療性單抗產(chǎn)品準(zhǔn)備生產(chǎn)，3個治療性產(chǎn)品處于臨床試驗階段，多個抗體藥物處于臨床研究階段，已經(jīng)批準(zhǔn)的治療性單抗有31個，目前國內(nèi)正在進(jìn)行臨床前研究的抗體藥物有：抗CEA嵌合抗體；抗破傷風(fēng)抗體及抗乙型腦炎等[6]。

3 藥物篩選

藥物篩選是從天然或合成的化合物中篩選出高效的新藥或先導(dǎo)化合物。生物活性和藥理作用檢測所篩選出的高效的新藥或先導(dǎo)化合物，并根據(jù)檢測結(jié)果評價某一物質(zhì)的藥用前景，是新藥研究的最初過程和關(guān)鍵步驟。體外二維和應(yīng)用球狀聚集體、細(xì)胞片層、脫細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行三維培養(yǎng)肝細(xì)胞的具體技術(shù)是進(jìn)行藥物毒性檢測的重要途徑[7]。Kostadinava等建立了一種長時間的三維肝細(xì)胞共培養(yǎng)體系，比單層培養(yǎng)肝細(xì)胞能更好地檢測體內(nèi)藥物導(dǎo)致的毒性。細(xì)胞水平的藥物篩選更接近人體生理狀態(tài)，外界環(huán)境干擾少，準(zhǔn)確率高，是細(xì)胞水平藥物篩選模型的核心技術(shù)高內(nèi)涵篩選。高內(nèi)涵藥物篩選主要在微陣列多孔板上完成，通過在微孔板上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，施加藥物刺激進(jìn)行實驗操作和數(shù)據(jù)的采集和分析。HCS技術(shù)可完成各種對于細(xì)胞生理現(xiàn)象本質(zhì)的研究，Talyor等[8]提出高內(nèi)涵概念，HCS模型主要建立在細(xì)胞水平，通過觀察樣品對固定或動態(tài)細(xì)胞的多個功能的作用，涉及各種不同的靶點，從多個角度分析樣品的作用，最終確定樣品的活性和可能的毒性。近年來發(fā)展起來的微流控芯片技術(shù)有可能成為細(xì)胞水平藥物篩選的理想選擇。Ye等[9]構(gòu)建了一套用于細(xì)胞水平藥物篩選研究的集成化微流控芯片系統(tǒng)，它可以將細(xì)胞種植、培養(yǎng)、標(biāo)記、加藥、梯度稀釋等操作通過微通道網(wǎng)絡(luò)流體控制技術(shù)集成到一張芯片完成，保持了細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，可全面記錄細(xì)胞對藥物刺激的各種反應(yīng)。

4 基因重組產(chǎn)品

基因工程藥物是將人某一部位的基因，注入到質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入工程菌或工程細(xì)胞中，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)或細(xì)菌培養(yǎng)，充分表達(dá)擴(kuò)增后，分離，純化而得。基因重組產(chǎn)品與天然型的生物學(xué)活性一致，其結(jié)構(gòu)分為兩種，一種與天然型的一樣；另一種稍有區(qū)別，如人白細(xì)胞介素是糖蛋白質(zhì)，但糖鏈的有無對其機(jī)能無影響，故重組的不含糖鏈。哺乳動物細(xì)胞已成為生物制藥最重要的表達(dá)或生產(chǎn)系統(tǒng)，F(xiàn)DA（美國食品藥品管理局）在2000年以后批準(zhǔn)的創(chuàng)新生物技術(shù)藥物，用酵母表達(dá)的有2種，用大腸桿菌表達(dá)的產(chǎn)品只有4種，而通過動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的生物技術(shù)產(chǎn)品則有22種，除兩種組織工程產(chǎn)品外，其余都是蛋白類產(chǎn)品，這些蛋白都是分子量大、二硫鍵多、空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖蛋白，只有使用CHO等哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，這些蛋白的生產(chǎn)才成為可能。建立CHO細(xì)胞表達(dá)的重組人白細(xì)胞介素-12（rhIL-12）的純化工藝，趙峰等[10]取高效表達(dá)rhIL-12的CHO工程細(xì)胞培養(yǎng)上清液，分離純化、定量計算、對純化產(chǎn)品進(jìn)行鑒定及檢測rhIL-12的生物活性，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)純化產(chǎn)物回收率和純度高，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

5 前景與展望

細(xì)胞培養(yǎng)是模擬機(jī)體內(nèi)的生理環(huán)境，使細(xì)胞維持生長、繁殖的技術(shù)。目前，世界眾多領(lǐng)域集中在優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，改變細(xì)胞特性，提高產(chǎn)品的產(chǎn)率并保證其質(zhì)量和一致性上。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)過不斷的研究和完善，已經(jīng)成為實驗室常用的制藥研究方法，廣泛應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)、單克隆抗體制備、藥物篩選、基因重組的生產(chǎn)等領(lǐng)域。

隨著現(xiàn)代醫(yī)藥生物技術(shù)的發(fā)展、人類基因組計劃的完成及遺傳病基因的不斷發(fā)現(xiàn)，越來越多的人類功能基因得到克隆、表達(dá)和應(yīng)用。目前基因重組技術(shù)、蛋白質(zhì)工程、抗體工程、細(xì)胞工程和基因治療等新技術(shù)的研究取得重大突破與發(fā)展，為醫(yī)藥制藥技術(shù)開拓了一個新領(lǐng)域，并為產(chǎn)生大量有益于人類健康的醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)，我們有理由相信細(xì)胞培養(yǎng)在生物制藥領(lǐng)域會取得更大的突破。

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