基于ITS序列分析18個茶樹菇菌株的親緣關系

王洪秀，魏云輝*，靳 亮，胡中娥，李 菁，陳慶隆，李勝杰，鐘國祥

(1.江西省農業科學院農業應用微生物研究所, 江西 南昌 330200; 2.江西省科學院微生物研究所, 江西 南昌 330096)

基于ITS序列分析18個茶樹菇菌株的親緣關系

王洪秀1，魏云輝1*，靳 亮2，胡中娥1，李 菁1，陳慶隆1，李勝杰1，鐘國祥1

(1.江西省農業科學院農業應用微生物研究所, 江西 南昌 330200; 2.江西省科學院微生物研究所, 江西 南昌 330096)

采用ITS 序列分析方法，對供試18株(4株野生菌株、7株工廠化栽培菌株、5株經鈷60輻照誘變菌株和2株搭載神十的航天誘變菌株)茶樹菇菌株進行研究。結果表明，供試菌種的ITS序列長度為703～721 bp，與GenBank數據庫中茶樹菇菌種的ITS序列相似度為99 %以上，在種的水平上證明供試菌種為茶樹菇。運用構建的系統發育樹將供試菌種聚為6個類群，其中Cha3與Cha3shen，AS-2與AS-2-600，AS-1與AS-1shen、AS-1-700，分別聚在了不同的類群，說明這7株茶樹菇菌株可能由于輻照或航天誘變后使得ITS序列存在著種內的變異。ITS序列分析結果從系統發育角度反映出了研究菌株的遺傳關系，是進行茶樹菇菌株遺傳分析及科學鑒定的重要工具。

茶樹菇；輻照誘變；航天誘變；ITS序列分析

茶樹菇(Agrocybeaegerita)隸屬于真菌門(Eumycota)、擔子菌亞門(Basidiomycotina)、傘菌目(Agaricales)、糞銹傘科(Bolbitiaceae)、田頭菇屬(Agrocybe)。野生的茶樹菇生長在茶樹、楊柳樹等腐爛的樹木上，分布于中國的福建、云南、浙江及四川等地。由于其生長宿主的多樣性及形態上的細微差別，又被命名為楊樹菇、柳松茸、柳環菌、柱狀田頭菇(Agrocybecylindracea)、茶薪菇(Agrocybechaxingu)、油菜菇等[1]。茶樹菇因其蓋肥柄脆、口味鮮美、營養豐富而被譽為“中華神菇”。含有鐵、鋅、鈣等10多種微量元素，以及人體所需要的17種氨基酸(尤其是人體不能合成的7種氨基酸含量特別高)[2]。有些地方人們還當作藥物來治療胃寒、腎炎水腫等慢性病[3]，近代研究表明茶樹菇不僅能抗神經衰弱，而且對高膽固醇及高血脂有一定療效果[4]，甚至有報道表明茶樹菇有一定抗腫瘤功效[5]。長期以來，一方面由于有關茶樹菇系統地位的報道較少，導致了命名上的混亂。另一方面，國內外對茶樹菇的遺傳多樣性也鮮有報道[6-11]。因為茶樹菇的巨大經濟價值，目前在國內很多省份均有栽培。但是同大部分人工栽培食藥用菌一樣，也面臨著品種退化的威脅。因此，從各種環境中搜集野生資源，對現有品種進行誘變馴化，以及對所分離菌株的準確鑒定就愈發顯得重要。

真菌核糖體基因轉錄間隔區(internal transcribed spacer，ITS)，又叫內轉錄間隔區，是位于真菌核糖體DNA(rDNA)上18S和28S基因之間的區域，包括內轉錄間隔區1(ITS1)、5.8S rDNA、內轉錄間隔區2(ITS2)[12]。在大多數生物中，18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA序列趨于保守，種間變化較小，作為非編碼區的ITS1區和ITS2區，在進化過程中承受較小的自然選擇壓力，所以相對變化較大，可提供系統學分析所需的詳盡的可遺傳性狀[13]。真菌的rDNA的ITS區段的保守性基本上表現為種內相對一致、種間差異比較明顯，這一特點使得ITS區段不僅適合于屬內物種間或種內差異較明顯的菌群間的系統發育關系分析，而且非常適合于真菌物種的分子鑒定[14]。許多學者利用不同物種中或同一物種不同菌株間ITS序列的差異來進行真菌系統發育或分類鑒定等方面的研究[15-19]。

本文首次運用ITS序列分析結合堿基比對，對18個供試的茶樹菇野生菌株、工廠化栽培菌株、經鈷60輻照誘變菌株和航天誘變菌株的ITS序列特征構建指紋圖譜，揭示其系統發育關系，為茶樹菇的品種選育、資源保護、遺傳學研究等提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 茶樹菇Agrocybeaegerita的18個供試菌株，詳見表1。其中4株是野生菌株(編號1～4)、7株是工廠化栽培菌株(編號5～11)、5株是經鈷60(劑量為600、700和800 Gy)輻照誘變菌株(編號12～16)、2株是搭載神十的航天誘變菌株(編號17～18)。大腸桿菌Escherichiacoli菌株DH5α由本實驗室保存。

表1 茶樹菇18個供試菌株

注：1～4：野生菌株；5～11：工廠化栽培菌株；12～16：經鈷60(劑量為600、700和800Gy)輻照誘變菌株；17～18：搭載神十的航天誘變菌株。 Note: 1-4: Wild strains; 5-11: Factory cultivation strains; 12-16: Cobalt-60 irradiation induced strains (dose: 600, 700 and 800 Gy); 17-18: Aerospace mutation strains carried by the Shenzhou 10 spacecraft.

1.1.2 主要培養基 PDA培養基制作方法參考方中達[20]的方法，LB培養基參考于飛進和陳衛良[21]的方法。

1.1.3 生化試劑 TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒(DP305)(北京天根生化科技有限公司)，TaqDNA聚合酶、克隆T載體pMD18-T、dNTP、瓊脂糖(大連寶生物工程有限公司)，PCR引物(上海立非生物技術有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株培養及DNA的提取 接種少量菌絲體到PDA固體培養基上，25 ℃恒溫培養至菌絲長滿平板。將長滿平板的菌絲用灼燒滅菌過的接種鏟刮取至1.5 mL的Eppendorf管中，加入液氮研磨至粉狀，按照試劑盒使用說明書的方法提取供試材料的DNA，提取的DNA置于-20 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2 ITS區段通用引物的擴增 選用真菌ITS擴增的通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG -3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[22]，對供試的各個菌株進行ITS區段PCR擴增。反應在25 μl體系中進行，各組分如下：2.5 mmol/L dNTP 2 μl、5 U/μlTaq酶0.2 μl、10 × PCR buffer 2.5 μl、5 μmol/L引物ITS1 1 μl、5 μmol/L引物ITS41 μl、基因組DNA 1 μl，加ddH2O至25 μl。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。4 ℃保存。

1.2.3 目的片段的克隆與測序 從瓊脂糖凝膠上將700 bp左右的ITS擴增條帶切下，克隆到pMD18-T載體，用熱擊法轉入大腸桿菌感受態細胞，37 ℃在LB培養基上培養12～16 h，挑取陽性轉化子，將LB菌液送交上海立非生物技術有限公司測序。

1.2.4 序列分析與系統發育樹構建 測得的ITS序列通過BLAST軟件進行同源序列比較，選擇了與供試菌ITS序列相似度99 %以上的6條序列，以香菇的ITS序列為外類群構建系統發育樹[23-25]。采用Clustal X程序進行多序列匹配排列，然后通過MEGA4.0程序中的Neighbor-Joining(NJ)方法、采用Jukes-Cantor計算模型構建系統發育樹，進行1000次Bootstrap可信度分析，Kimura 2-parameter法計算遺傳距離，空位作為完全缺失(Complete deletion)處理，設置相同的轉換(Transition，Ti)和顛換(Transversion，Tv)權重。

M：DL2000 Marker；1～16：不同菌株的PCR產物；CK：對照M: DL2000 Marker; 1-16: PCR products of different isolates; CK: Control圖1 茶樹菇菌株ITS1/4引物的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of isolates from Agrocybe aegerita with ITS1/4 primers

1.2.5 序列登錄號 將本實驗中所得到的供試菌株ITS序列提交GenBank登記，序列號如下：KT148846-KT148863。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增

PCR產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶清晰(圖1)，大小在720 bp左右。

2.2 ITS序列分析

經對位排列，去掉兩端不整齊部分得到18株供試菌的ITS比對序列，長度為703～721 bp(表2)，與GenBank數據庫中的茶樹菇菌種的ITS序列相似度為99 %以上，在種的水平上證明供試菌株為茶樹菇。在ITS序列中共有696個保守位點(Conserves sites)，27個變異位點(Variable sites)，9個簡約信息位點(Parsimony-informative sites)，18個單個堿基變化位點(Singleton sites)，存在插入與缺失。18株供試菌的ITS序列各堿基含量：A為21.2 %～22.1 %，平均值為21.7 %；T為30.1 %～30.8 %，平均值為30.5 %；G為23.7 %～24.1 %，平均值為23.8 %；C為23.6 %～24.2 %，平均值為23.9 %；G+C為47.4 %～48.2 %，平均值為47.7 %。G+C含量能反映屬種間的親緣關系，含量差異越小，親緣關系越近。本實驗供試菌的G+C含量差異不明顯，說明親緣關系較近[26](表2)。

表2 18個茶樹菇菌株ITS序列的序列長度及G+C含量

括號內的數字為GenBank序列號；結點處數字為Bootstrap值；標尺代表2 %的序列分歧Numbers in parenthesis represented GenBank accession No.. Numbers at the branch points indicated the bootstrap values. The scale bar represents a 2 % sequence divergence圖2 基于ITS序列構建的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS sequences

12345678910111213141516171Yangshushang2hao2AS?1?7000．01013AS?10．00720．00874AS?1shen0．00570．00720．00145AS?2?6000．00570．00720．00140．00006AS?20．00720．00580．00580．00430．00437Baicha7000．00720．01450．01160．01010．01010．01168Baicha0．00570．01310．01010．00860．00860．01010．00149Cha3?8000．00570．00720．00140．00000．00000．00430．01010．008610Cha30．00860．01010．00430．00290．00290．00720．01300．01150．002911Cha3shen0．00720．00580．00580．00430．00430．00290．01160．01010．00430．007212Cha5?8000．00570．01310．01010．00860．00860．01010．00140．00000．00860．01150．010113Cha50．00720．01450．01160．01010．01010．01160．00290．00140．01010．01300．01160．001414Chayuan1hao0．00580．01020．00720．00580．00580．00720．01010．00870．00580．00870．00720．00870．010115Chayuan2hao0．01300．01450．01450．01300．01300．01160．01160．01010．01300．01600．01160．01010．01160．013116Gu10．00720．00580．00290．00430．00430．00290．01160．01010．00430．00720．00290．01010．01160．00720．011617Gu20．00580．01010．01010．00870．00870．00720．01010．00870．00870．01160．00720．00870．01010．00870．01300．007218Yangshudong1hao0．00000．01010．00720．00570．00570．00720．00720．00570．00570．00860．00720．00570．00720．00580．01300．00720．0058

2.3 系統發育分析

采用N-J法構建系統發育樹進行系統發育分析(圖2)，結果表明,18株茶樹菇菌株聚成6個類群：第Ⅰ類群：Yangshushang2hao、Yangshudong1hao；第Ⅱ類群：Cha3-800、Cha3、Chayuan1hao、AS-2-600、AS-1shen；第Ⅲ類群：AS-1、Gu1；第Ⅳ類群：Gu2、AS-2、AS-1-700、Cha3shen；第Ⅴ類群：Baicha700、Cha5-800、Baicha、Cha5；第Ⅵ類群：Chayuan2hao。其中Cha3與Cha3shen，AS-2與AS-2-600，AS-1與AS-1shen、AS-1-700，分別聚在了不同的類群，說明這7株茶樹菇菌株可能由于輻照或航天誘變后使得ITS序列存在著種內的變異。系統發育分析中18個菌株聚為6個分支，應視為6個遺傳株系，分支間遺傳距離較大，可在遺傳分支間挑選親本菌株進行雜交育種，以便充分發揮雜交后代遺傳互補優勢。

基于Kimura 2-parameter距離模式進行遺傳距離分析(表3)，結果表明18株供試菌的成對序列遺傳距離范圍為0.0000～0.0160，總體平均遺傳距離為0.0079，Yangshushang2hao與Yangshudong1hao，Baicha與Cha5-800，Cha3-800與AS-1shen、AS-2-600，以及AS-2-600與AS-1shen，這4組菌間的遺傳距離為0，不存在遺傳分化，應為相同菌株[27]；余下11株菌種(AS-1-700、AS-1、AS-2、Baicha700、Cha3、Cha3shen、Cha5、Chayuan1hao、Chayuan2hao、Gu1、Gu2)間的遺傳距離大于0，存在一定的遺傳差距，因此經ITS序列初步分析，將供試的18株菌種定為14個菌。

3 討 論

由于ITS區不加入成熟核糖體，所以受到的選擇壓力較小，進化速率較快，在絕大多數的真核生物中表現出了極為廣泛的序列多態性；同時ITS序列長度適中，從人類到酵母的各種真核生物中ITS的序列長度約為300～1000 bp。因此，可以從不太長的序列中獲得足夠的信息，已受到真菌分類學者的廣泛關注。rDNA-ITS序列變異較快，可提供比較豐富的變異位點和信息位點，因此可作為一種分子標記用于探討真菌種內變異和屬內種間分子系統關系[28-31]。近年來，Xiao等利用rDNA-ITS序列提出了冬蟲夏草種復合群體及其包含的3個隱存種的假設[32]，曹杰等利用ITS序列分析證明8種鵝膏菌的種間具有較高的遺傳多樣性[33]。由于ITS序列具有方便、快速的特點，因此也用于鑒定一些未知植株，如侯軍等利用ITS序列對疑似菌株白羊肚菌進行了初步分子鑒定[34]，李小林等結合形態學特征觀察和ITS序列分析對2株耐高溫野生柱狀田頭菇進行鑒定及系統發育地位的研究[35]。

AS-1、AS-2、Gu1、Gu2、Baicha、Cha5為重要的茶樹菇主栽品種，在ITS序列分析中，AS-1和Gu1聚在一個分支，AS-2和Gu2聚在一個分支，Baicha和Cha5聚在一個分支，三者分屬不同的遺傳分支，系統發育關系較遠。栽培中可以將3類菌株搭配種植，以擴大栽培菌株間的遺傳背景，利于改良栽培品種結構，提高茶樹菇栽培品種對環境、病蟲害等因素的適應性。

Cha3與Cha3shen，AS-2與AS-2-600，AS-1與AS-1shen、AS-1-700，分別聚在了不同的類群，說明這7株茶樹菇菌株可能由于輻照或航天誘變后使得ITS序列存在著種內的變異。菌株經輻照或航天誘變產生的變異可以改變菌株因長期栽培導致的菌種退化。也可以選擇產生有利性狀的誘變菌株作為父母本進行雜交，增強后代的雜種優勢。

Yangshushang2hao、Yangshudong1hao、Chayuan1hao、Chayuan2hao菌株為野生分離菌株，在ITS序列分析中Yangshushang2hao、Yangshudong1hao、Chayuan1hao與Cha3-800、Cha3、AS-2-600、AS-1shen系統發育關系很近。但因其采自野生環境，具有特有的環境適應性、抗逆性等優良特性，能夠作為優良親本菌株在育種中得到較好應用。

在ITS序列分析試驗中，獲得了18個茶樹菇菌株的ITS特征指紋圖譜，并被聚為6個分支，反映出了研究菌株的系統發育關系。試驗結果從系統發育角度分析得到了研究菌株的遺傳關系，其研究結果能夠直接應用于進一步的遺傳育種和種質鑒定等工作，是進行茶樹菇菌株遺傳分析及科學鑒定的重要工具。由于受時間和條件限制，研究供試的茶樹菇菌株較少，在今后研究中將進一步擴大取樣數量和取樣范圍。

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(責任編輯 李山云)

Analysis on Genetic Relationships of 18AgrocybeaegeritaStrains Based on ITS Sequence

WANG Hong-xiu1, WEI Yun-hui1*, JIN Liang2, HU Zhong-e1, LI Jing1, CHEN Qing-long1, LI Sheng-jie1, ZHONG Guo-xiang1

(1.Institute of Agricultural Applied Microbiology, Jiangxi Agricultural Academy of Sciences, Jiangxi Nanchang 330200, China; 2. Institute of Microbiology, Jiangxi Academy of Sciences, Jiangxi Nanchang 330096, China)

18 testedAgrocybeaegeritastrains (4 wild strains, 7 factory cultivation strains, 5 Cobalt-60 irradiation induced strains, 2 aerospace mutation strains carried by the Shenzhou 10 spacecraft) by ITS sequence analysis were studied. The results showed that the lengths of ITS sequences ofAgrocybeaegeritastrains were 703-721 bp, and their ITS sequence similarity in the GenBank database was more than 99 %, which indicated that the tested strains wereAgrocybeaegeritaat the specific level. Phylogenetic tree was also constructed that the tested strains were clustered into six groups, of which Cha3 and Cha3shen, AS-2 and AS-2-600, AS-1 and AS-1shen and AS-1-700 were respectively clustered into different groups, which indicated that there were intraspecific variations for ITS sequences of these seven strains under the conditions of irradiation or aerospace mutation. The phylogenetic relationships were distinctly delineated using ITS sequencing, which was an important tool in the genetic analysis and identification ofAgrocybeaegerita.

Agrocybeaegerita; Radiation mutation; Aerospace mutation; ITS sequence analysis

1001-4829(2016)09-2038-07

10.16213/j.cnki.scjas.2016.09.006

2015-09-10

國家自然科學基金項目(31460490)；中國科學院農業與環境微生物學重點實驗室開放研究基金項目(2014AEM003)；江西省青年科學基金項目(20142BAB214021)；南昌市對外科技合作與成果轉化推廣計劃項目(2013HZCG019)；江西省農業科學院創新基金博士啟動項目(2012CBS006)

王洪秀(1981-)，女，黑龍江海倫人，博士，主要研究方向為食藥用菌遺傳育種、資源化利用及栽培技術研究，E-mail:wanghongxiu0624@163.com，Tel：13607045429，*為通訊作者，E-mail:yunhuiwei@sina.com。

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